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May 14, 2023

カーボンの構造再構築

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 1001 (2023) この記事を引用

2243 アクセス

32 オルトメトリック

メトリクスの詳細

大腸菌では、炭素リンリアーゼをコードする 14 シストロンの phn オペロンにより、CP 結合を含む広範囲の安定なホスホネート化合物からのリンの利用が可能になります。 複雑な多段階経路の一部として、PhnJ サブユニットはラジカル機構を介して CP 結合を切断することが示されましたが、反応の詳細は 220 kDa PhnGHIJ CP リアーゼ コアの結晶構造とすぐには一致しませんでした。複雑なため、細菌のホスホン酸分解についての理解に大きなギャップが残されています。 今回我々は、単粒子極低温電子顕微鏡を用いて、PhnJがATP結合カセットタンパク質の二重二量体であるPhnKとPhnLのコア複合体への結合を媒介していることを示す。 ATP 加水分解は、コア複合体の開口と、PhnI サブユニットと PhnJ サブユニット間の界面に位置する金属結合部位および推定上の活性部位の再構成につながる大幅な構造再構築を誘導します。

細菌は、環境からリン、硫黄、窒素、炭素などの必須主要栄養素を抽出するための精巧な機構を進化させてきました。 グラム陰性大腸菌では、リン酸塩の制限により Pho レギュロンと 14 シストロン phn オペロン (phnCDEFGHIJKLMNOP) の発現が誘導され、リンの代替供給源としてホスホン酸塩の取り込みと分解が可能になります 1,2,3。 ホスホン酸塩は、リン酸エステルや他の一次代謝産物と構造的に似ていますが、加水分解による切断に耐性のある非常に安定した炭素-リン (C-P) 結合を含んでいます4。 したがって、ホスホネートは阻害剤および遷移状態類似体として機能することができ、洗剤、除草剤（グリホサート/ラウンドアップ®など）および抗生物質として産業界で非常に有用です5。 phn オペロンは、分解と取り込みに必要な完全な酵素機構 (PhnGHIJKLMNOP) に加えて、ホスホン酸取り込み 6 、転写調節因子 (PhnF) 7 のための ATP 結合カセット (ABC) インポーター (PhnCE) およびペリプラズム結合タンパク質 (PhnD) をコードしています。 5-ホスホ-α-D-リボシル-1-二リン酸（PRPP）を介して一般代謝に関与します8,9,10,11。 C-P リアーゼ経路は非常に幅広い基質スペクトルを持ち、脂肪族および嵩高い芳香族ホスホネートを処理できます 10、12、13。 このため、またホスホネートの多くの応用により、C-P リアーゼによるホスホネートの分解機構を理解することに根本的な強い関心が寄せられています。 phnオペロンによってコードされる個々の酵素サブユニットの詳細な機能的および機構的研究により、PhnIによって触媒される反応およびPhnIの存在下での核酸塩基の置換を介して、ホスホン酸部分が最初にATPまたはGTPのいずれかに結合するという提案された反応機構が導き出された。 PhnG、PhnH、および PhnL8。 PhnM は、生成した 5'-ホスホリボシル-α-1-ホスホネートからピロリン酸を放出し、厳密に嫌気性の S-アデノシル メチオニン (SAM) 依存性のグリシン ラジカル反応機構を介して PhnJ が C-P 結合を切断できるようにすることが示されました。 最後に、PhnP と PhnN の組み合わせ作用により、結果として生じる環状リボースが PRPP に変換されます (補足図 1)9,10。

しかし、反応の複雑さ、多数のタンパク質サブユニットと複合体が関与すること、嫌気性要件などにより、C-P リアーゼ経路の完全な機構を理解することはまだ不可能です。 コア酵素複合体である Phn(GH​​IJ)2 の結晶構造から、PhnI および PhnG サブユニットのコンパクトな中央四量体から構成される対称ヘテロ八量体が、それぞれより遠位の PhnJ および PhnH サブユニットと個別に相互作用していることが明らかになりました。 この構造の興味深い特徴は、おそらくラジカル形成と酵素活性化に必要とされる Fe4S4 クラスターの部位が、PhnJ のグリシン残基からかなりの距離 (30 Å) に位置していることです。このことは重水素交換研究によって示されています。酵素代謝回転サイクル間のラジカルの安定した位置15。 結晶構造はまた、PhnI と PhnJ の界面に、PhnI の 2 つの保存された His 残基によって配位された Zn2+ イオンを含む別の推定活性部位を明らかにし、両方ともホスホネート上での成長に必須であることが示されました。 最後に、phn オペロンによってコードされる 2 つの非輸送体 ABC モジュール、PhnK および PhnL のうち、PhnK の単一サブユニットが、中央挿入ドメイン (CID) として知られる保存されたヘリックス領域を介して PhnJ に結合できることが判明しました 14。 細菌では、ABC モジュールは主に代謝産物インポーターと関連しており、膜貫通ドメインと二量体として相互作用して ATP に結合して加水分解し、濃度勾配に対する輸送に必要なエネルギーと運動を生成します 16。 したがって、ABCモジュールの一般的な二量体構造は、C-Pリアーゼコア複合体に結合する単一のPhnKサブユニットの機能を理解する上でほとんど役に立ちませんでした。 さらに、この矛盾は、観察された構造が酵素の真の機能状態を表していない可能性を示唆し、他の必須の ABC モジュールである PhnL の存在の理論的根拠を提供しませんでした。 この研究では、PhnK と PhnL の両方の ATPase 活性がホスホネート上での大腸菌の増殖に必要であることを遺伝学的および酵素学的に示し、極低温電子顕微鏡 (cryo-EM) を使用して C-P 上の 2 つのサブユニットの二重二量体を明らかにしました。リアーゼコア複合体。 ATP代謝回転条件下での構造解析により、加水分解によりコア複合体が開き、PhnIサブユニットとPhnJサブユニットの間に位置するZn2+活性部位が露出し、再配置されることがさらに明らかになった。

ABC サブユニットと C-P リアーゼの相互作用、および触媒におけるこれらのモジュールの役割をより深く理解するために、最初に、前述のように His タグ付き PhnK を含む PhnGHIJK をコードするプラスミドから PhnK 結合コア複合体を精製し、高分解能の解析を行った。クライオEMによる精製C-Pリアーゼ複合体の構造（補足図2aおよび補足図3）。 901,800 個の粒子を使用して生成された初期マップでは、単一の PhnK サブユニットに結合した C-P リアーゼ コア複合体の全体解像度 2.2 Å (ゴールドスタンダード フーリエ シェル相関 (FSC) 0.143 カットオフ基準 17 を使用) の構造が得られました。以前に観察されました (図 1a)14,16。 PhnK は、コアの PhnGHIJ 複合体よりも大幅に低い解像度を示したので、シグナル減算による 3D 分類を使用して、PhnK に焦点を絞って精密化を行い、解像度 2.6 Å で 50,323 個の粒子からなる最終クラスを取得しました。 このマップでは、PhnK の密度が向上し、タンパク質の完全な折り畳みの追跡が可能になりました (図 1a、補足図 3、および補足表 1)。 変動性分析により、相互作用部位周囲のABCドメインのヒンジ様の動きを表すPhnKのいくつかの異なる位置が明らかになりました（図1b）18、19。 PhnKとPhnJのCIDとの特異的相互作用は、主にPhnJ上の負に帯電した残基（Glu149、Asp226、Asp228、およびAsp229）とPhnK上の正のパッチ（Arg78、Arg82、およびArg116）を含む静電相互作用によって駆動されます（図1c） 、d）。 これらの相互作用は、PhnJ Tyr158 と PhnK Tyr118 の間の疎水性相互作用によってさらに安定化されます。 PhnK は、ABC トランスポーターの細胞質ドメインと同様の古典的ヌクレオチド結合ドメイン (NBD) フォールドを採用しており、すべての保存された触媒モチーフ (ウォーカー A/B、Q ループ、ABC シグネチャー、および H スイッチ、図 1d、e) を含んでいます。そのうち、ATP 結合と加水分解に直接関与しています20。 3Dクラスのサブセットでは、PhnKのPループ近くに追加のEM密度が見られました（図1eおよび補足図2b）。 この密度は、ABCトランスポーターのNBDモジュール内のATPの密度と部分的に重複していますが（図1f）、高解像度の特徴がないことは、ヌクレオチド結合が乱れており、その結果、PhnKが触媒能力のある状態にないことを示唆しています。 これは、ABC モジュールが二量体状態でのみ活性であるという一般的な理解と一致しています。 要約すると、単一の PhnK サブユニットが C-P リアーゼ コア複合体に結合すると、その構造が乱れ、ATP 加水分解に参加できなくなると結論付けます。 さらに、以前の観察とは対照的に16、単一サブユニットPhnKの結合時に、推定Fe4S4クラスター部位を含むPhnGHIJコア複合体に重大な構造変化は観察されません（rmsd = 0.5Å、補足図2c）。

PhnKの単一サブユニット（赤）に結合したC – Pリアーゼコア複合体（PhnGHIJ、青/緑）の構造の概要と、個々のサブユニットの名前が示されています。 PhnK の ATP 結合ポケットは青い楕円で示されています。 b PhnKで観察された傾斜運動の範囲を示すEM密度の表面表現。 2 つの極端な状態は、それぞれ灰色と赤色で示されています。 c PhnK (赤) と PhnJ 中央挿入ドメイン (CID、青) の間の相互作用の拡大図。関連する残基はラベル付きの棒と相互作用を破線で示します。 d PhnK (上、赤) および PhnJ (下、青) のドメイン構造の概要と残基番号を示します。 PhnK の場合、コア ABC モチーフ (ウォーカー A および B、Q ループ、シグネチャー モチーフ、および H スイッチ) の位置がオレンジ色で示され、C 末端ドメインが暗赤色で示されます。 PhnJ の場合、相同である PhnH とタンパク質を区別する特徴 (中央挿入ドメイン、CID、残基 129 ～ 169、および C 末端ドメイン、CTD、残基 235 ～ 281) が濃い青色で示されています。 Fe4S4 クラスター結合に関与する C 末端近くの 4 つの Cys 残基は C で示されています。タンパク質間の相互作用は破線で示されています。 e 触媒的に重要な残基（Tyr15、Aループ; Gln90、Qループ; Asp170 / Glu171、ウォーカーAモチーフ; His204、Hループ）をスティックとして示すPhnKの拡大図。 ヌクレオチド結合部位でいくつかの 3D クラスで観察された余分な密度が青色で示されています。 f ヌクレオチド (AMPPNP) および触媒的に重要な残基 (Tyr349、A ループ; Gln422、Q ループ; Glu503、ウォーカー A モチーフ; His534、H) と同じ方向にある黄色ブドウ球菌 Sav1866 多剤トランスポーター ABC ドメイン (2ONJ)24 の構造ループ) は棒として、Mg2+ イオンは紫色の球として表示されます。

PhnKを安定したヌクレオチド結合立体構造で捕捉するために、ウォーカーBモチーフにE171Q変異を導入しました（図1e）。これは、ABCモジュールのATPの結合は可能ですが、加水分解は不可能であることが知られています21。 次に、PhnK 上の C 末端二重 Strep タグを使用し、非加水分解性 ATP 類似体である β,γ-イミドアデノシン 5' の存在下で、完全な酵素機構 (PhnGHIJKLMNOP) をコードするプラスミドから発現した CP リアーゼ複合体を精製しました。 -三リン酸塩（AMPPNP）。 2.1 Åの分解能でのクライオEM単一粒子分析による構造決定（59,737個の粒子、C2対称性、補足図4および補足表1）により、ATP結合状態を彷彿とさせる立体構造でPhnKの二量体に結合しているコア複合体が明らかになりました。 ABC トランスポーターの構造 (図 2a、b、赤色のサブユニット)。 2つのPhnKサブユニットの境界面では、AMPPNPの明確な密度により、両方の活性部位ポケットのヌクレオチドのモデリングが可能になりました（図2cおよび補足図5a）。 PhnK の内部では、アデノシンヌクレオチドは、膜関連 ABC モジュールで観察されたものと非常によく似た方法で結合します (補足図 5d)。 単一の PhnK サブユニットが結合している場合と比較して、ATP に結合した PhnK の二量体状態と関連付けられた場合、C – P リアーゼ コア複合体の間に構造的な違いは観察されません（rmsd = 0.3 Å、補足図5e）。 注目すべきことに、この構造は、PhnKサブユニットの上部に位置する追加のタンパク質の2つのコピーも明らかにし、質量分析とEM密度の検査によってPhnLとして同定できました（図2a、b、黄色のサブユニット、および補足図6a） ）。 PhnL は PhnK と同様の NBD フォールドを持ちますが、トランスポーターの ABC モジュールにも見られる保存された C 末端ドメインが欠如していることと、β1 と β2 の伸長から生じる N 末端近くの長い β ヘアピンの存在が異なります (図 1)。 2a、b、β-エクステンション、緑色）。 したがって、ＰｈｎＬサブユニットと２つのＰｈｎＫサブユニットのそれぞれとの結合により、ＡＢＣサブユニットの二重二量体が生成され、その両方が互いおよびコア複合体に関して同じ配向にあり、したがって潜在的にヌクレオチド結合が可能である。 このヘテロ十二量体、327 kDa 複合体では、PhnL は開いた ADP 様の状態にあり、目に見えるヌクレオチドの密度はありません。 PhnK と PhnL 間の相互作用は、広範囲の特異的相互作用によって媒介されますが、主に PhnK の拡張 C 末端ドメインを介します。このドメインには、拡張 β ヘアピンを含む PhnL とのほとんどの接触を促進する 2 つの α ヘリックス (α8 および α9) が含まれています (図.2d–f)。 相互作用は主にイオン性であり、PhnKの結合領域（上側）は全体的に負電荷（残基231〜247）を持ち、PhnL（下側）は正電荷を帯びています（補足図6b）。 さらに、PhnK Trp29とPhnL Arg82の間にはπ-πスタッキングがあります（図2d）。 PhnLのArgはオルソログで完全に保存されていますが、PhnKのTrpはスタッキング能力のために機能的に保存されています（補足図6c）。 要約すると、我々は、phn オペロンによってコードされる非トランスポーター ABC サブユニットである PhnK と PhnL の両方が、PhnK が ATP 結合状態にあり、PhnL が ATP 結合状態にある二重二量体構造で C-P リアーゼ コア複合体に同時に結合できると結論付けます。閉じたときの ATP 結合と互換性のある開いた状態。 我々の知る限り、2つのABC二量体間のこの種の相互作用はこれまで観察されておらず、したがってABCヌクレオチド結合ドメインのこれまで認識されていない機能様式を表している。

a 上、PhnL (上、黄色) および PhnK (下、赤色) のドメイン構造と配列の特徴の概要。残基番号が示されています。 コア ATPase モチーフ (Walker A および B、Q ループ、シグネチャー モチーフ、H スイッチ) はオレンジ色で示され、PhnL の β ヘアピン拡張部分 (残基 7 ～ 14) は緑色で示され、PhnK の C 末端ドメインは濃い赤色で表示されます。 タンパク質間の相互作用は破線で示されています。 b PhnGHIJKLの構造の概要。CPリアーゼコア複合体PhnGHIJは青/緑の色合いで、残りの半分は対応する明るい色、PhnK二量体は赤/薄赤、PhnL二量体は黄色/薄黄色で表示されます。 ボックスは、クローズアップ ビュー (c ～ f) のおおよその位置を示します。 c PhnK ATP 結合部位の詳細。AMPPNP (白/オレンジ) は、関連する相互作用する側鎖 (標識された棒) と並んで示され、Mg2+ イオンは青い球体として示されます。 d PhnK Trp29 と PhnL Arg82 の間にスタッキング相互作用が観察されました。 e PhnK C末端（ヘリックスα8およびα9、残基236〜247）とPhnL βヘアピン伸長（残基7〜14）の間の相互作用。 f PhnK C末端領域（残基210〜236）とPhnLの間に観察された荷電相互作用。

PhnK とコア複合体間の特異的相互作用の重要性、およびホスホン酸分解における PhnK と PhnL の機能的完全性を調べるために、特定の残基の変更が大腸菌の増殖能力に影響を与えるかどうかを遺伝子相補性を使用してテストしました。リンの唯一の供給源としてのホスホン酸塩（図 3a）。 ホスホネート上で増殖する能力を欠く大腸菌株 HO1488 (ΔphnHIJKLMNOP) は、phn オペロン (pSKA03、詳細は「方法」を参照) のプラスミド保有コピーの導入によってレスキューできるため、機能的効果をテストするために使用できます。個々のタンパク質の変異体の数。 最初に、HO1488株がメチルホスホネートまたは2-アミノエチルホスホネートのいずれかを含む最少培地で増殖できないことは、pSKA03の導入によって遺伝的に補完できることを示すことができました（図3a）。 PhnK-PhnJ 相互作用界面に位置する重要な残基 (PhnJ E149A、Y158A または PhnK R78A/R82A) の破壊、または触媒活性グルタミン酸の変異 (PhnK E171Q または PhnL E175Q) による PhnK または PhnL の ATPase 活性の阻害は、再び廃止されました。リンの唯一の供給源としてホスホネートで成長します。 総合すると、これは、インビボでのホスホネート分解には、PhnK および PhnL とコア複合体との相互作用、およびこれらのサブユニットの ATPase 活性の両方が必要であることを示しています。

a プラスミドなしで増殖させた大腸菌 HO1488 株 (ΔphnHIJKLMNOP) (ΔphnHIJKLMNOP)、または pho ボックスを含む phn オペロン全体を含み、以下の特定の変異を含む pSKA03 で補完した大腸菌 HO1488 株 (ΔphnHIJKLMNOP) を使用した in vivo 機能アッセイ: wt (なし)、PhnJ Y158A、 PhnJ E149A、PhnK R78A/R82A、PhnK E171Q、および PhnL E175Q。 細胞を、K2HPO4、2-AmEtPn、MePn、または示されているようにリン源を添加しない（Pなし）のいずれかを含むMOPS最小寒天プレート44上にプレーティングしました。 プレートは 2 つの繰り返しを表しています。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 b 精製Phn(GH​​IJKL)2野生型、Phn(GH​​IJKL)2-PhnK E171Q (PhnK E171Q)、およびPhn(GH​​IJKL)2-PhnL E175Q (PhnL E175Q)を使用したATPアーゼ活性。一晩後のイオン交換クロマトグラフィーによるヌクレオチド種の分離によって測定ATPとのインキュベーション。 c Phn(GH​​IJKL)2 野生型 (wt)、Phn(GH​​IJKL)2-PhnK E171Q (PhnK E171Q)、Phn(GH​​IJKL)2-PhnL E175Q (PhnL E175Q) を使用した共役アッセイ ATPase 活性 (μmol/分/mg)、および二重変異体 Phn(GH​​IJKL)2-PhnK E171Q-PhnL E175Q (E171Q/E175Q)。 バーは 3 つの独立した反応からの平均を示し、エラーバーは平均からの標準偏差を示します。 負の値を持つ 1 つの測定値が E171Q/E175Q から除外されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

ATP加水分解は大腸菌がホスホネート上で増殖する能力に不可欠であるため、次に我々は、PhnKおよびPhnLに結合するC-Pリアーゼコア複合体であるPhn(GH​​IJKL)2がin vitroでATP加水分解において活性であるかどうかを調べた。 これに答えるために、精製された野生型、およびPhnKおよびPhnLの不活化複合体（補足図7a、b）を、ATPおよびMg2+とインキュベートし、続いてヌクレオチドのクロマトグラフィー分離によってATPアーゼ活性について個別に分析しました（図3b）。共役酵素ATPaseアッセイによるものなど（図3c）。 どちらの技術も、野生型 PhnGHIJKL 複合体に対する明らかな ATPase 活性を明らかにしましたが、Phn(GH​​IJ)2K 複合体は無視できる活性を示しました (補足図 7c)。これは、ATPase 活性に対する完全な ABC 二量体の存在の要件と一致しています。 単一のPhnK E171QおよびPhnL E171Q変異体の両方について、ATPアーゼ活性の大幅な低下が観察されました。これは、PhnKが不活性である場合にわずかに顕著でしたが、PhnK E171Q/PhnL E171Qの二重変異体では、活性は完全に存在しませんでした（図3c）。 要約すると、我々の機能データは、C-P リアーゼの ATPase 活性には ABC サブユニットの二量体が必要であり、in vivo と in vitro の両方で最大の活性を得るには PhnK と PhnL の両方が必要であることを明確に示しています。 さらに、生体内でホスホン酸分解が起こるためには、両方のサブユニットが C-P リアーゼコア複合体に結合できなければなりません。

PhnK および PhnL の ATPase 活性から生じる複合体の潜在的な追加の立体構造状態を捕捉するために、次に、ATP および EDTA の存在下で野生型 Phn(GH​​IJKL)2 複合体を精製し (最初に PhnK による ATP 加水分解を防ぐため)、その後添加した過剰な Mg2+ を除去して、クライオ EM グリッドにスポットし、急冷する直前に反応を開始します。 これらの条件下でのクライオEMデータの収集と処理により、222,056個の粒子の最終セットを使用し、C2対称性を課すことによって、1.9Åに及ぶPhn(GH​​IJKL)2複合体の高分解能構造を含む、いくつかの機能状態の構造が得られました（補足図。 8、9および補足表1)。 この状態は、AMPPNP の存在下で決定された構造と本質的に同じですが、高解像度 EM マップで PhnK 活性部位を詳しく調べると、ADP と Pi が含まれており、その結果、真の ATP 加水分解後の状態を表すことが明らかになりました (補足)図5b)。 また、PhnLの両方のヌクレオチド結合部位へのATPの結合も観察されますが、それにもかかわらず、二量体はまだ開いたADP様状態にあります（補足図10a）。

ATP代謝回転条件下で収集されたデータの3D分類により、PhnK、場合によってはPhnLに結合したコア複合体の2つの追加状態の構造が得られました（図4a、b、補足図8、9、および補足表1）。 どちらの構造でも、PhnKの密度は安定したPhnL結合状態よりも大幅に低く、より柔軟であることを示唆しており、したがってPhnLがPhnKの閉じた立体構造を安定化させるように作用している可能性があります（補足図10b、c）。 これらの立体構造の 1 つ (閉じた、2.0 Å、81,605 個の粒子、C2 対称) では、PhnK 二量体は閉じた ATP 結合状態にあり、Phn(GH​​IJKL)2 構造で見られる構造に似ていますが、PhnL の密度は存在しません。 活性部位を検査すると、ATPとMg2+の両方の明確な密度が明らかになり、これが加水分解前のATP結合状態であることを示唆しています（図4aおよび補足図5cおよび10d、e）。 もう一方の構造（開いた、2.6Å、31.280粒子、C1対称）では、2つのPhnKサブユニットのうちの1つは閉位置から25Å離れましたが、もう1つは所定の位置に留まりました（図4b）。

Phn(GH​​IJK)2 複合体で閉じた状態 (a) と開いた状態 (b) の間で起こる構造変化の概要。 Phn(GH​​IJK)2 複合体は、C-P リアーゼ コア複合体が青/緑の色合いで、PhnK が赤/薄赤色で表された表面表現として示されています。 矢印は、Zn2+ サイトの開口部の範囲を示します。 c 閉じた状態（上）と開いた状態（下）のPhnIとPhnJの間の界面にある推定活性部位の詳細。 Zn2+ イオンは、配位幾何学が示され、標識されたスティックと関連する相互作用する残基を備えた灰色の球として示されています。 d 閉じた状態（上）と開いた状態（下）でモデル化された、5-ホスホ-α-D-リボース-1,2-環状リン酸（PRcP）の結合分子を含む活性部位ポケットの詳細。 e 閉じた状態（上）のPhnGHIJK複合体の表面から開いた状態（下）の活性部位へのPhnI N 末端とPhnG C 末端の協調した動き。

PhnK がコア複合体に結合しているため、この動きにより、PhnJ および PhnH サブユニットの 1 セットがコアの残りの部分から引き離され、その過程で PhnI-PhnJ に位置する Zn2+ 結合および推定活性部位が露出します。インターフェース（図4b）。 両方の PhnK サブユニットは柔軟であるように見え (単一の PhnK サブユニットが結合した構造と同様)、複合体の残りの部分よりも大幅に低い局所解像度を示します。 この柔軟性のため、PhnL は開いた状態でモデル化できませんでしたが、2D クラスの検査により、PhnL が存在し、おそらく閉じた ATP 様構造であることが確認されました (補足図 10d、e)。 これは、PhnK 二量体の開口が PhnL ATP 加水分解を活性化するトリガーである可能性があることを示唆しています。 柔軟性のため、PhnL が閉じた (ATP 加水分解後の) 状態でも存在するかどうかは不明です。

コア複合体がこれまでのすべての構造でモノリシックであると考えられることを考えると、開いた状態での PhnK、PhnJ、および PhnH の同時移動は、重要な機能的意味を持つ C-P リアーゼの構造的再配置を表します。 閉じた状態では、両方の PhnI サブユニットと 1 つの PhnJ サブユニットが緊密に相互作用して、3 つのタンパク質の界面に位置する Zn2+ 結合部位 (His 部位) を形成します 14。 PhnI に由来する 2 つのヒスチジン残基 (His328、His333) に加えて、Zn2+ イオンは 3 つの水分子と未知のリガンドからの酸素によって八面体配置で配位されており、これは X 線結晶構造解析によって以前に観察されたものです (図 1)。 4c、閉じた状態、および補足図 11a)14。 EM 密度の検査に基づいて、リガンドを 5-ホスホ-α-D-リボース-1,2-環状リン酸 (PRcP、補足図 1 および 11b) としてモデル化することができました 8,10。 これは C-P リアーゼ経路の中間体ですが、タンパク質の発現はホスホネートの非存在下で行われたため、ホスホネートの非存在下での過剰発現中の副反応で形成され、ホスホネートの非存在下で過剰発現中に運ばれた可能性があると考えられます。精製。 存在する化合物の量が微量であるため (350 kDa 複合体あたり 2 分子)、UPLC-QTOF-MS 示差分析による同定の試みは成功しませんでした。 リガンドは、リボース部分と PhnJ Arg107 および Gln124 の間の特異的相互作用、PhnJ の 5' リン酸とループ (残基 47 ～ 50) の間の接触、そして最後に 1,2-環状リン酸、PhnJ His108、およびZn2+（補足図11b）。 また、この配向では天然基質のホスホン酸原子の位置に対応する位置の隣に大きな空洞があることにも注目しました。これは、結合した化合物が反応中間体を模倣していることを裏付けており、C-P の幅広い基質特異性を説明できる可能性があります。リアーゼ（補足図11c）。

反対に、開状態の Zn2+ 部位ではリガンド密度は観察されず、再配列が起こり、閉状態のリガンドの 5' リン酸と相互作用する PhnJ のループが完全に改造されています (図 1)。 4d）、近くのPhnI鎖からのHis219とPhnIのN末端NH2基が、現在は四面体であるZn2+配位球を完成させることができます（図4c、白抜き、および補足図11d）。 一方、閉じた状態で PRcP の 1,2-環状リン酸基と相互作用する PhnJ の His108 は、金属イオンから約 11 Å 離れた位置に移動しました。 PhnJ と PhnH には内部再配列がほとんどなく、活性部位ポケットの内側を覆う PhnJ ループ 37 ～ 49 を除いて、剛体に近い動きをしているように見えます (これらのサブユニットの開状態構造と閉状態構造の間の rmsd = 0.6 Å)。 Zn2+ イオンの周囲の再配列に対応するのに役立ちます。 これは、PhnJ システイン残基 241、244、266、および 272 を含む推定上の Fe4S4 クラスター部位と、PhnJ Gly32 の推定ラジカル部位との間の構造関係および距離に変化がないことも意味します。 コア複合体の開いた状態では、Gly32は、活性部位キャビティ近くの表面から約10Å、Zn2+イオンから31ÅのPhnJ内部に埋められています（補足図11e）。

PhnG の伸長した C 末端は、閉じた状態では C-P リアーゼ コア複合体の外側に位置し、小さな逆平行 β モチーフを使用して PhnI の N 末端と緊密な相互作用を形成し、PhnI N とともに運ばれます。 Zn2+部位に再配置され、PhnJのポケットに隠れるための終端です（図4e）。 したがって、PhnI 末端と PhnG 末端は共に、どちらの場合も 30 Å 以上の協調的な動きを起こし、これはおそらくいくつかの重要な機能的意味を持つ構造変化です。 開いた状態での Zn2+ 配位における PhnI の両方の鎖の関与は、ABC 二量体を結合するための対称性要件とともに、C-P リアーゼ コア複合体が PhnGHIJ の二量体でなければならない理由も説明していることに注目します。 -C-Pリアーゼの高次構造の理由に関する難題。

この研究では、ABCモジュールPhnKおよびPhnLに結合した大腸菌CPリアーゼコア複合体のいくつかの状態の構造を提示し、コアとの相互作用もATP結合自体も酵素の立体構造を変化させないことを示しています。 これは、トランスポーターにおける ABC モジュールの古典的な役割とは異なります。ATP 結合は、よりコンパクトな状態を誘導するだけでなく、外反や外側に開いた状態をもたらす膜貫通セグメントの変化を誘導することが知られています 22。 したがって、C-Pリアーゼコア複合体の安定な基底状態（つまり、ABCモジュールの非存在下で観察される状態）は、PhnKのATP結合立体構造と互換性があると考えられます。 また、C-Pリアーゼコア複合体上にPhnKの二量体が存在すると、相同なABCモジュールであるPhnLの同様の二量体が二重ATPアーゼ配置で会合することも示す。 そして重要なことは、生体内と生体外の両方で、ATP 代謝回転には両方の ABC モジュールの活性が必要であることを示すことができたことです。 ホスホネートの分解中になぜ、いつ ATPase 活性が必要になるのかはまだ明らかではありませんが、この観察により、ATPase の活性化と、ATP 加水分解が 2 セットのタンパク質で同時に起こるのか、それとも連続して起こるのかについて、いくつかの疑問が生じます。 ATP代謝回転条件下での構造決定により、コア複合体およびADP + Piに結合したPhnKの加水分解後の閉じた構造を捕捉することができました。 ABC トランスポーターの場合、ATP 加水分解時の Pi とエネルギーの急速な放出により、この立体構造を捕捉するのは困難です 23。そのため、この結果は、PhnL が PhnK からのリン酸放出を制御する役割を果たしていることを示唆しており、したがって 2 つのタイプの必要性の説明も提供する可能性があります。 ABCモジュールの。

PhnKとPhnLは両方とも、対応するNBDがABCトランスポーターの膜貫通ドメインに結合するため、それぞれのパートナーであるC-Pリアーゼコア複合体とPhnKに対して同じ向きで結合しますが、相互作用領域の構造は両方の場合で異なります。 ABCトランスポーターに見られる典型的な結合ヘリックスから。 どちらの場合も、NBDとそのパートナー間の相互作用には別の結合幾何学が使用され、PhnLの伸長βヘアピンやPhnKのC末端ドメインなどの特別な要素が必要とされるようです（図2a、b、および図5）。 興味深いことに、この C 末端ドメインは、黄色ブドウ球菌の多剤トランスポーターである Sav1866 などのトランスポーターの ABC モジュールによく見られます (図 5a および 5d)24。 C-P リアーゼで観察される PhnK と PhnL の二重二量体は、私たちの知る限り、ABC モジュールではこれまで観察されていなかったため、これらのタンパク質がどのようにパートナーと相互作用できるかについてのレパートリーを大幅に拡大しました。 さらに、C-Pリアーゼコア複合体はトランスポーターの膜貫通セグメントとは無関係であるため、ABC結合パートナーの全体的な折り畳みは、界面での特定の相互作用よりも相互作用にとって重要ではないことも示しています。 上で仮説を立てたように、PhnL は加水分解後の PhnK からの Pi 放出を阻害するように機能する可能性があり、したがって ATP 加水分解から生成されるエネルギーが放出されるタイミングを制御し、示されているようにコア複合体を破壊する可能性があります。 EM 密度は、PhnK の C 末端領域が PhnL の存在下でより秩序化されることを示唆しています (補足図 10b、c)。 この効果はヘリックス 6 と D ループにまで広がり、Pi の放出を制御するゲートとして機能する可能性があります。 このモデルでは、PhnL による PhnK D ループの安定化により、Pi の放出が防止されます。

ADP結合構造の黄色ブドウ球菌Sav1866 ABCトランスポーターの構造の概要。ABCモジュールは緑色、膜貫通ドメインは灰色で示されているが、両者間の相互作用を担うカップリングヘリックスは除き、シアンで示されている。 (2HYD)24 b ATP 結合立体配座の PhnK E171Q の二量体を含む CP リアーゼ コア複合体の構造の概要。PhnK 二量体は赤色、CP リアーゼ コア複合体は PhnJ 中央挿入ドメイン (CID) を除き、灰色で示されています。 、PhnK結合を担当しており、青色で示されています。 c オープン構造でPhnLに結合したPhnK ABC二量体の構造の概要。PhnL二量体は黄色、PhnKは灰色で示されているが、相互作用に関与するC末端領域は赤色で示されている。 d 黄色ブドウ球菌Sav1866 ABCトランスポーターATP結合部位（ADPに結合）の詳細。 e PhnK ATP 結合部位 (AMPPNP に結合) の詳細。 f PhnL 活性部位に結合した ATP の詳細。

C-Pリアーゼコア複合体がこれまでのすべての構造でモノリシックに見えたことを考えると、閉じた立体構造から開いた立体構造への構造再配置は重要であり、この経路によるホスホン酸分解の複雑な触媒プロセスを理解する新しい方法を提供すると考えられます。 おそらく、PhnIとPhnJの間の金属結合部位のアクセス不可能な性質により、閉じた状態でのリガンドの解離が妨げられると考えられます。 逆に、これは、錯体の開放と Zn2+ イオンの完全な占有が基質交換を誘発する可能性があることも示唆しています。 さらに言えば、基質の結合はコア複合体を閉じるための要件である可能性があり、これにより、閉じた状態の Zn2+ 付近のリガンドに常に密度が存在する理由が説明されます 14。 したがって、ここで示した結果を総合すると、反応サイクルの一部中に C-P リアーゼで起こる構造再配置のモデルを提案することができます (図 6)。 最初、コア複合体は基質が結合した閉鎖状態にあり、PhnK は ATP 状態、PhnL は半開状態になります (図 6、左上)。 これは、PhnK 上の ATP 加水分解だけでなく、酵素の活性部位での反応を引き起こす可能性があります。 その後、2 つの PhnK サブユニットが押し広げられ、コア複合体が開き、PhnL の閉鎖が可能になります。 この状態では、活性部位が開いており、基質/生成物の交換が起こる可能性があります (図 6、右下)。 別の基質がその部位に結合すると、PhnL のコアの新たな閉鎖と ATP 加水分解が引き起こされ、続いて PhnL 二量体が開きます。

C-P リアーゼの考えられる機能サイクルを示す概略モデル。色は既知の (観察された) 状態、灰色は推定上の状態を示します。 左上では、C-P リアーゼ コア複合体 (PhnGHIJ、青色) が、PhnK (赤色、ATP 結合状態) と PhnL (部分的に開いた状態) の 2 つの二量体および基質に結合します。 この複合体は、おそらくコア複合体での反応、およびPhnK二量体でのATP加水分解とPi放出を引き起こす前に、PhnLのATPに結合することができます。 PhnK ATP 加水分解によりコアが開いて生成物が放出される一方、PhnL サブユニットは閉じた二量体を形成し、基質が交換されます。 新たな基質結合に続いて、ATP結合状態で2つのPhnKサブユニットを近接させながらコアが閉じます。 最後に、PhnL は ATP を加水分解し、ADP + Pi を放出し、分離して開始位置に戻ります。

しかし、現段階では、これらの再構成が化学変換経路のどの部分で起こるのかは正確には明らかではありませんが、いくつかの証拠は、これがまさに最初のステップである可能性を示唆しており、これには PhnG、PhnH、PhnI、および PhnI の両方が関与することが示されています。 PhnL および ATP (補足図 1)。 細菌の C-P リアーゼ機構の反応機構は、35 年以上前に発見されて以来、生物学における未解決の難題のままです 2,13。 経路の化学的複雑さ、相互作用する多数のタンパク質ドメインと酵素、それらの内部依存性、および嫌気性反応条件の要件により、組み合わせが困難であることが証明されています。 しかし、近年、生化学的側面と構造的側面の両方で着実な進歩が見られ、この魅力的な分子システムの内部の秘密の一部が徐々に明らかになり始めています8、14、15。 ここから先に進むには、Fe4S4 クラスターの自然な取り込みを可能にする穏やかな発現条件を使用して、嫌気条件下で酵素を研究することが重要であると考えています。 さらに、CP リアーゼの機能がその細胞内局在化に関連している可能性があります。 したがって、全体像を得るには、できるだけ自然な状態に近づき、細胞内で起こる反応を研究する必要があります。

PhnK 上の C 末端 His タグを持つ PhnGHJIK をコードするプラスミド pHO575 を大腸菌株 HO2735 (Δ(lac)X74 ΔphnCDEFGHIJKLMNOP 33–30/F lacIq zzf::Tn10)14 に導入しました。 細胞を、37℃の振盪インキュベーター内で100μg/mLアンピシリンを含むLuria Bertani（LB）培地中でOD600が0.5に達するまで増殖させ、その時点で0.5mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを使用して遺伝子発現を誘導した(IPTG)。 発現は 20 °C で一晩行われ、その後遠心分離によって細胞が収集され、50 mM HEPES/NaOH pH 7.5、150 mM NaCl、20 mM イミダゾール、5 mM MgCl2、3 mM β-メルカプトエタノール (BME)、 20% (v/v) グリセロール、および 1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド (PMSF)、超音波処理によって溶解し、23,400 × g で 45 分間、4 °C で遠心分離しました。 上清を 5 mL の平衡化済み His-Trap HP カラム (Cytiva) にロードし、50 mM HEPES/NaOH pH 7.5、650 mM NaCl、20 mM イミダゾール、5 mM MgCl2、3 mM BME、および 20% ( v/v) グリセロール、続いて 50 mM HEPES/NaOH pH 7.5、150 mM NaCl、20 mM イミダゾール、5 mM MgCl2、3 mM BME、20% (v/v) グリセロール、および 50 mM イミダゾールを加えて同じバッファーで溶出300 mM イミダゾールを含む。 精製サンプルを、50 mM HEPES/NaOH pH 7.5、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、および 5 mM BME であらかじめ平衡化した 1 mL Source 15Q (Cytiva) にロードし、洗浄し、100 ～ 800 mM の直線勾配を使用して溶出しました。 20 カラム容量 (CV) を超える NaCl。 PhnGHIJK を含むサンプルは、MonoQ カラムにロードする前に約 100 mM NaCl に希釈し、50 mM HEPES/NaOH pH 7.5、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、および 5 mM BME であらかじめ平衡化し、100 ～ 100 ～ 100 の勾配を使用して溶出しました。 36 CV で 500 mM NaCl。 個々のピークをプールし、Vivaspin 20 限外濾過フィルターを使用して濃縮した後、50 mM HEPES pH 7.5、125 mM NaCl、および 5 mM BME であらかじめ平衡化した Superdex 200 Increase 10/300 GL サイズ排除カラムにロードしました。 最後に、クライオ EM グリッドに使用するまでピーク画分を氷上で保存しました。

Cryo-EM グリッド (C-Flat 1.2/1.3 400 メッシュ銅グリッド、Protochips) を、3 μL の精製 Phn(GH​​IJ)2K (1.7 mg/mL)、ブロッティング (6 ～ 7 秒)、5 °C、湿度 100%、エタン温度 -184 °C に設定した Leica プランジ冷凍庫 EM GP2 を使用した液体エタン中でのプランジ凍結。 EM データは、英国のダイヤモンド光源にある電子バイオイメージング センター (eBIC) で、直接電子検出器 (Gatan K3) を備えた Titan Krios 300 keV で収集されました。このエネルギー フィルターは、SerialEM25 を使用してスリット幅 20 eV で動作します。データ収集。 17,088 本のムービーが、総露光量 52 e-/Å2 に相当する 1.3 e-/Å2/フレームの線量で 40 フレームにわたってフレームあたり 0.2 秒の露光で収集され、焦点ぼけは公称値の -0.7 ～ -2.0 μm の範囲でした。倍率は 135,000 に設定され、カウント モードでは物理ピクセル サイズは 0.83 Å になりました。 データ収集の品質は、relion_it.py を介してストリーミング モードで RELION-326 を実行することで監視されました。

フレームベースの動き補正は RELION の MotionCor227 実装を使用して実行され、CTF 推定は RELION-3 内の Gctf28 を使用して実行されました。 顕微鏡写真のサブセットは、8.75 倍のビニングと 2D 分類による抽出の前に、RELION-3 でのラプラシアン オブ ガウス ピッキングに使用されました。 良好な 2D クラスはテンプレート ベースのピッキングのテンプレートとして使用され、その後これらの粒子は 6 回のビニングを使用して抽出され、2D 分類が実行されて不良粒子が除去されました。 次に、4 回のビニングを使用して粒子が再抽出され、その後、初期モデルの生成と 3D 分類が行われました。 PhnGHIJK に似た結果の 3D クラスは、1,329,400 個のパーティクルのスタックで構成されていました。 RELION-3 での 2 回目の 3D 分類と、cryoSPARC (Structura Biotechnology Inc.)29 での不均一精製により、最終的に 901,800 個の粒子のスタックが得られました。 その後、これらの粒子は RELION-3.1 に戻され、ベイジアン研磨、粒子ごとの CTF 精密化、高次収差の推定、ビーム傾斜、異方性倍率 30 を使用してさらに精密化されました。 RELION-3.1 での自動調整後、マスキングによる FSC 解像度は 2.18 Å に達しました。 結果として得られたマップは、コア複合体 (PhnGHIJ) の非常に詳細な情報を示し、X 線結晶構造解析によって以前に決定された構造とよく一致しました 14 が、PhnK サブユニットは著しく低い局所解像度を示しました。 PhnK の構造を改善するために、補足図 3 で詳述するように、信号減算と 3D 変動による 3D 分類が使用されました 18,19。PhnK の解釈可能な密度を示す結果のクラスからの粒子が再抽出され、新しい 3D 自動リファインメントの実行に使用されました。 結果として得られたマップの FSC 解像度は 2.57 Å で、PhnK のローカル解像度が向上しました。 初期モデルは、Phn(GH​​IJ)2 (4XB6)14 の公開された構造と、UCSF Chimera32 を使用した剛体モデリング用の Phyre231 からの PhnK の予測モデルを使用して構築されました。 このモデルはさらに、Namdinator33 を使用してマップに適合され、高解像度のマップ領域については Coot34 で手動で構築され、解像度と解釈可能性が低い領域には ISOLDE35 が使用されました。 最終モデルは、Phenix 実空間改良を使用して改良および検証されました 36,37。

Phn(GH​​IJKL)2 発現用の pRBS01 は、ギブソンアセンブリ 38 を使用して、pBW12039 からの phnGHIJKLMNOP の増幅と、phnK の 3 ' 末端に TEV-2xStrep タグをコードする配列の挿入によって構築されました (プラスミドとプライマーについては補足表 2 および 3 を参照)この作品でも使用されています）。 線状化ｐＥＴ２８ａは、プライマーＲＢＳ０１およびＲＢＳ０２を使用するＰＣＲによって調製され、一方、ＴＥＶ－２ｘ－Ｓｔｒｅｐ部位は、プライマーＲＢＳ０３およびＲＢＳ０４を使用してｇＢｌｏｃｋ配列から調製された。 phn 遺伝子を含む 2 つの断片を、それぞれプライマー RBS05 + RBS06 (phnGHIJK) および RBS07 + RBS08 (phnLMNOP) を使用して pBW120 から調製しました。 線状プラスミドを 2 ～ 3 倍過剰の 3 つのインサート断片と混合し、続いて Gibson Assembly® Master Mix (New England Biolabs) を添加し、50 °C で 60 分間インキュベートしました。 構築したプラスミドを大腸菌株NEB 10-βコンピテントセル(New England Biolabs)に形質転換し、50μg/mLカナマイシンを含むLB寒天上にプレーティングした。 PhnK/PhnL 変異体は、pRBS01 を鋳型とし、プライマーセット SKA01 + SKA02 (PhnK E171Q) および SCO01 + SCO02 (PhnL E175Q) を使用して PCR によって構築しました。 二重変異体は、連続的な PCR 変異誘発反応でこれら 2 つのプライマー セットを使用して構築されました。

クライオEM分析のために、pRBS01-PhnK E171Qをコンピテント大腸菌Lemo21細胞(New England Biolabs)に形質転換した。 細胞を、1 mM IPTGを添加する前に、300 μM L-ラムノース、34 μg/mL クロラムフェニコール、および50 μg/mL カナマイシンを含むLB培地でOD600 ～0.5まで増殖させた。 細胞は採取前に 37 °C で 3 ～ 4 時間インキュベートされました。 収集した細胞を、25 mM HEPES/KOH pH 7.5、125 mM KCl、5 mM MgCl2、10% グリセロール、5 mM BME、1 μg/mL DNase I、1 mM PMSF、および 5 μM アデノシン-5'を含む溶解バッファーに再懸濁しました。 -[(β-γ)-イミド]三リン酸 (AMPPNP) を超音波処理により溶解します。 23,400 × g、4 °C で 45 分間の遠心分離によってライセートを清澄にし、8 °C に保たれ、溶解バッファーであらかじめ平衡化された 1 mL StrepTrap HP カラム (Cytiva) にロードしました。 カラムを 10 CV の StrepTrap 洗浄緩衝液 (25 mM HEPES/KOH pH 7.5、125 mM KCl、5 mM MgCl2、5 mM BME、および 5 mM AMPPNP) で洗浄した後、2.5 mM D を含む 5 CV のこの緩衝液で溶出しました。 -デスチオビオチン。 関連する画分をSDS-PAGEで分析し、氷上で保存しました。

StrepTrap 洗浄バッファーで 2.5 mg/mL の濃度に希釈した 3 μL の新たに精製したタンパク質を分注する直前に、UltrAuFoil 0.6/1 グリッドをグロー放電 (10 mA、90 秒、GloQube、Quorum) し、続いてブロッティング (7 ～ 9 秒)ライカ プランジ フリーザー EM GP2 を使用し、5 °C、湿度 100%、エタン温度 -184 °C に調整した液体エタン中での即時プランジ凍結。 クライオ EM データは、デンマーク国立クライオ EM 施設 (EMBION) – AU ノード (iNANO、オーフス大学) で、K3 直接電子検出器 (Gatan) を使用して 300 keV で動作する Titan Krios G3i (Thermo Fisher Scientific) 上で取得されました。スリット幅 20 eV の生物量子エネルギー フィルター (Gatan) と自動データ収集用の EPU (Thermo Fisher Scientific)。 データは公称倍率 130,000 のカウント超解像度モードで収集され、その場でゲイン補正を行った後、EPU で 2 倍のビニングが行われ、物理ピクセル サイズ (0.647 Å/ピクセル) で映画が出力されました。 各グリッド正方形についてユーセントリック高さを決定し、-0.5 ～ -1.4 μm のデフォーカス範囲および 56 フレームにわたって 62 e-/Å2 の電子フルエンスを使用してデータを取得しました。 データ品質は、cryoSPARC Live を通じて監視され、最初に処理されました。

すべてのデータはcryoSPARC内で処理されました。 最初に、顕微鏡写真はパッチの動きを補正し、続いてパッチの CTF 推定とさまざまなデータ品質指標を使用したフィルタリングが行われました。 粒子は最初にガウスブロブピッカーを使用して選択され、その後 4 つのビンに分けられた粒子が抽出され、2D 分類が行われました。 良好な 2D クラスからの粒子が保持され、14 枚の顕微鏡写真のサブセットを使用した手動ピッキング ジョブが開始され、より多くの粒子がピッキングされました。 採取された粒子の収集セットはディープ ピッカーのトレーニングに使用され、その後モデルは残りの 4502 枚の顕微鏡写真から粒子を採取するために使用されました。

データ処理戦略を補足図4に示します。簡単に説明すると、4倍ビニングを使用して合計1,530,855個の粒子が抽出され、2D分類の対象となりました。その後、優れた2Dクラスの選択と、5つのクラスを使用した3D ab initio再構築と、同じクラス。 Phn(GH​​IJKL)2 構造を示すクラスは均一精製を受け、整列した粒子は 3D 変動解析に使用されました 19。 3D 変動解析では、5.5 Å にフィルタリングされた分解能で 3 つの直交主モードが決定され、主モードを使用して粒子を 4 つの異なるクラスターにクラスタリングすることによって、異なる立体構造の粒子が分離されました。 1 つのクラスターが選択され、このクラスの粒子は 1.48 倍のビニングされた 420 × 420 ピクセル ボックスでの抽出後のローカル モーション補正に使用され、適用された C2 対称によるリファインメントに使用され、59,737 個の粒子に対して最終的な FSC 解像度が 2.09 Å になりました。 このマップは、ローカル解像度を決定し、ローカル フィルタリングとローカル解像度データを使用したシャープ化中にさらに処理されました。 モデル構築では、PhnGHIJ コア複合体と Phn(GH​​IJ)2K 構造の PhnK を ChimeraX40 を使用してマップに個別にドッキングし、Phyre231 を使用して PhnL モデルを生成しました。 モデルは、ISOLDE35 を使用した個々の鎖の修正とリガンドとイオンの追加に続いて、Namdinator33 を使用したマップ フィッティングによってさらに改善されました。 モデルは Coot34 で検査され、マップに表示されるときに追加の残基が追加されました。 最終モデルは、Phenix 実空間改良を使用して改良および検証されました 36。

ｐＲＢＳ０１からの野生型ＰｈｎＫによるＰｈｎ（ＧＨＩＪＫＬ）２の発現および精製は、ＰｈｎＫ Ｅ１７１Ｑ変異体と同じプロトコルに従った。 StrepTrap 精製後、サンプルを TEV プロテアーゼ (1:50 w/w TEV プロテアーゼ) で 8 °C で一晩処理し、その後サンプルを 25 mM で事前に平衡化した MonoQ 5/50 カラム (Cytiva) にロードしました。 HEPES/KOH、100 mM KCl、5 mM MgCl2、10% グリセロール、5 mM BME、および 1 μM AMPPNP)。 36 CV にわたる 200 ～ 450 mM KCl の勾配を使用してタンパク質を溶出し、その後個々のピークをプールしました。 Phn(GH​​IJKL)2 サンプルを Vivaspin 20 フィルターを使用して濃縮し、25 mM HEPES/KOH、125 mM KCl、0.5 mM EDTA、5 mM BME、および 0.25 mM で平衡化した Superdex 200増加 10/300 カラム (Cytiva) にロードしました。 ATP。 精製したタンパク質を濃縮し、4 °C で保存しました。

精製した Phn(GH​​IJKL)2 (2.5 mg/mL) のサンプルを氷上に置き、1.5 mM の濃度の ATP とインキュベートし、続いて MgCl2 を 6 mM の濃度まで添加して ATPase 反応を活性化し、その後 15 分間インキュベートしました。 37 °C、湿度 100%、エタン温度 100% に設定した Leica プランジフリーザー EM GP2 を使用して、グロー放電 (10 mA、90 秒、GloQube、Quorum) で UltrAuFoil 0.6/1 グリッドを直ちにプランジ凍結します。 −184 °C、ブロッティング時間は 6 ～ 9 秒。 データは Phn(GH​​IJKL)2-PhnK E171Q と同様の方法で取得され、cryoSPARC 内で処理されました。 顕微鏡写真はパッチの動きを補正し、続いてパッチ CTF 推定を行い、さまざまなデータ品質指標を使用してフィルタリングしました。 粒子は最初にガウスブロブピッカーを使用して選択され、その後 4 つのビンに分けられた粒子が抽出され、2D 分類が行われました。 明確な 2D クラスからの粒子が保持され、14 枚の顕微鏡写真のサブセットを使用した手動ピッキング ジョブが開始され、より多くの粒子がピッキングされました。 採取された粒子の収集セットはディープ ピッカーのトレーニングに使用され、その後モデルは残りの 3741 枚の顕微鏡写真から粒子を採取するために使用されました。

Phn(GH​​IJKL)2-Phn E171Q データセットと同様に、3741 枚の顕微鏡写真からの 1,155,385 個の粒子を使用して、初期データ処理が実行されました。 データ処理戦略を補足図に示します。 選択された粒子は 2.75 倍のビニングを使用して抽出され、良好な 2D クラスの選択に続いて 2D 分類が行われました。 2D 分類から選択された粒子は、4 つのクラスを使用した 3D ab initio 再構成に使用され、タンパク質のような特徴を示すクラスからの粒子は不均一な精製に使用されました 41。 不均一精製から得られた粒子は 3D 変動解析 19 に供され、6 Å までフィルタリングされた分解能で決定された 3 つの直交主モードを使用して異なる立体構造を互いに分離しました。その後、異なる立体構造からの粒子は次の方法で 8 つの異なるクラスターに分離されました。得られた主モードに従ってクラスタリングします。 Phn(GH​​IJKL)2 WT 構造の場合、2 つのクラスターが選択され、対応する粒子に粒子ごとのローカル運動補正が適用され、1.29 倍のビン化された 480 × 480 ピクセル ボックスに再抽出されました。 次に、222,056 個の粒子の最終セットを C2 対称性を使用した不均一な精製に使用し、FSC 解像度 1.93 Å の最終マップを取得しました（補足図 9a）。 Phn(GH​​IJK)2 閉じた立体配座の場合、1 つのクラスターが選択され、粒子が 1.42 倍のビン化された 386 × 386 ピクセル ボックスに再抽出されました。 81,605 個の粒子の最終セットは、C2 対称性による不均一な精製に使用され、FSC 解像度 1.98 Å のマップが得られました（補足図 9b）。 Phn(GH​​IJK)2 オープンコンホメーションの場合、最初のラウンドの 3D 可変性解析からの 4 つのクラスターを、別のラウンドの 3D 可変性解析およびクラスタリングに供しました。 1 つのクラスターが選択され、粒子は 1.42 倍のビニングされた 386 × 386 ピクセル ボックスに再抽出されました。 31,280 個の粒子の最終セットは不均一な精製に使用され、FSC 解像度 2.57 Å のマップが得られました（補足図 9c）。 このマップは、ローカル解像度を決定し、ローカル フィルタリングおよびローカル解像度データを使用したマップの鮮明化中にさらに処理されました。

Phn(GH​​IJKL)2 WT のモデル構築では、最終的な Phn(GH​​IJKL)2-PhnK E171Q モデルが最初にマップにドッキングされました。 リガンドを交換し、Phenix Douse36 を使用して水を追加し、Coot と ISOLDE を使用してモデルを手動で構築しました。 最終モデルは、Phenix 実空間リファインメントを使用してリファインされ、検証されました。 PhnI の Zn2+ 結合部位では、C. Lim および T. Dudev、200042 のデータを使用してリガンド結合長が抑制されました。Phn(GH​​IJK)2 オープン立体配座の場合、初期モデルは野生型 Phn(GH​​IJKL)2 構造に基づいていました。これは 2 つの部分に分割され、1 つは PhnG2HI2JK を含み、もう 1 つは PhnHJK を含み、それぞれオープンコア複合体の一方の側を表し、ChimeraX を使用して 2 つが個別にマップにドッキングされました。 モデルは ISOLDE と Coot を使用して再構築されましたが、局所解像度が低いため変更されなかった 2 つの PhnK 分子と PhnJ 分子の 1 つの一部を除きます。 最終モデルは、PhenK チェーンの改良を行わずに、Phenix 実空間改良を使用して改良および検証されました。 Phn(GH​​IJK)2 閉構造の場合、PhnL を含まない Phn(GH​​IJKL)2 構造が最初にマップにドッキングされ、リガンドが交換され、水分が除去されました。 最終モデルは、Phenix 実空間リファインメントを使用してリファインされました。

相補のために、ｐｈｏボックスを含むｐｈｎオペロン全体を含むプラスミド（ｐＳＫＡ０３）を、非必須配列の除去によりｐＢＷ１２０に基づいて構築した。 最初に、PCR を使用して 2 つの大きなフラグメント、プライマー SKA03 および SKA04 を使用してプラスミド バックボーン、およびプライマー SKA05 および SKA06 を使用して pho ボックスを含む phn オペロンを含むもう 1 つのフラグメントを作成しました。 生成物を制限エンドヌクレアーゼ DpnI で処理し、一緒に (それぞれ 300 ng) コンピテント大腸菌 NovaBlue 細胞に形質転換して、RecA 非依存性クローニングを達成しました 43。 プラスミド DNA を陽性クローンから精製し、ヌクレオチド配列決定によって確認しました。 続いて、PhnJ E149A、PhnJ Y158A、PhnK R78A/R82A、PhnK E171Q、およびPhnL E175Q点変異を、PhnJ E149AについてはプライマーSKA07およびSKA08、PhnJ Y158AについてはSKA09およびSKA10、PhnK R78AについてはSKA11およびSKA12を使用するPCRによって導入した。 /R82A 、PhnK E171Q の場合は SKA13 および SKA14、PhnL E175Q の場合は SKA15 および SKA16。 補完のために、ホスホン酸ノックアウト大腸菌株 HO1488 (ΔphnHIJKLMNOP) を使用しました。 HO1488株を50μg/mLカナマイシンを含むLB中でOD600が約0.3になるまで増殖させ、遠心分離によって濃縮し、200μLの氷冷TSB（LB中10％w/v PEG 3350、5％DMSO、および20mM MgCl2）に再懸濁しました。培地）を使用して、細胞を上記のプラスミドの DNA による熱ショックによる DNA 形質転換に適した状態にします。 形質転換細胞は、0.2% グルコース、100 μg/mL アンピシリン、34 μg/mL カナマイシン、および 0.2 mM の K2HPO4、2-アミノエチルホスホネート、メチルホスホネートのいずれかを含む、またはリン酸源を添加していない MOPS 最少寒天プレート 44 上で増殖させました。

Strep-tag 精製 Phn(GH​​IJKL)2 複合体 (野生型、PhnK E171Q、PhnL E175Q、および PhnK E171Q + PhnL E175Q) を、50 mM HEPES/KOH pH 7.5、300 mM 中で 5 mM ATP とともに約 200 nM の濃度でインキュベートしました。 KCl、10 mM MgCl2、および 5 mM BME、30 °C で一晩。 反応混合物の 1:20 希釈液 100 μL を、25 mM HEPES/KOH pH 7.5、5 mM MgCl2、および 5 mM BME であらかじめ平衡化した MonoQ カラム (Cytiva) にロードし、0 ～ 180 の勾配を使用して溶出しました。 7 CV にわたる mM KCl。 カラムは、潜在的な反応生成物の同定を可能にするために、ATP、ADP、AMP、およびアデニンの既知のサンプルを使用して校正されています。 ATPase 加水分解の定量的速度は、1 mM ホスホエノールピルビン酸を添加した 25 mM HEPES/KOH、125 mM KCl、0.5 mM EDTA、5 mM BME、および 0.25 mM ATP 中で 37 °C で実施される共役酵素アッセイによって測定されました。 μM NADH、0.04 mg/mL ピルビン酸キナーゼ、0.1 mg/mL 乳酸デヒドロゲナーゼ、10 mM MgCl2、および最終濃度 1 または 5 mM の ATP。 反応は、総量0.35 mL中の0.02 mgのStrepTrap精製野生型、PhnK E171Q、PhnL E171Q、またはPhnK E171Q/PhnL E175Q二重変異体を添加することによって開始され、最終タンパク質濃度は0.057 mg/mLとなった。 ATPからADPへの変換は、340nmで6.2L mM-1cm-1の吸光係数を使用して、測定されたNADH酸化速度から計算されました。 反応を 6 分間追跡し、NADH から NAD+ への分解への直線フィットを使用して反応速度を測定しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された構造データは、アクセッション コード 7Z19 および EMDB-14445 (Phn(GH​​IJ)2K)、7Z16 および EMDB-14442 (Phn(GH​​IJKL)2 PhnK-E171Q: AMPPNP)、7Z15 および EMDB-14441 (Phn(GH​​IJKL)2 WT:ADP + Pi)、7Z18 および EMDB-14444 (Phn(GH​​IJK)2 WT:ATP クローズ)、および 7Z17 および EMDB-14443 (Phn(GH​​IJK)2) WT:ATP オープン)。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、Ludo Renault、英国ダイヤモンド光源の電子バイオイメージングセンター (eBIC) の支援を受け、Instruct-ERIC センターであるライデン大学のオランダ電子ナノスコピーセンター (NeCEN) へのアクセスを通じて可能になりました。デンマーク国立低温EM施設（EMBION）オーフスノード（iNANO、デンマーク、オーフス大学）。 著者らはまた、オーフス大学電子顕微鏡コンピューティング クラスター (EMCC)、ATPase アッセイの支援をいただいた Thibaud Louis Antoine Dieudonné 氏、結合リン酸化代謝物の UPLC-QTOF-MS 示差分析の支援をいただいた Mogens Johannsen 氏と Camilla Bak Nielsen 氏に感謝します。 財政的支援は、Instruct-ERIC (PID 1514) およびノボ ノルディスク財団から DEB への助成金 (助成金番号 NNF18OC0030646) によって提供されました。

セーレン・K・アムストラップ & ニコラス・ソフォス

現在の住所: ノボ ノルディスク財団タンパク質研究センター、コペンハーゲン大学、Blegdamsvej 3B、DK-2200、コペンハーゲン N、デンマーク

分子生物学および遺伝学、オーフス大学、Universitetsbyen 81、DK-8000、オーフス C、デンマーク

ソーレン・K・アムストラップ、スイ・チン・オン、ニコラス・ソフォス、ジェスパー・L・カールセン、ラグンヒルト・B・スキルニング、ヤン・J・エンギルド、ビャルネ・ホーヴ＝イェンセン、ディトレフ・E・ブローデルセン

学際ナノサイエンスセンター (iNANO) オーフス大学、Gustav Wieds Vej 14、DK-8000、オーフス C、デンマーク

トーマス・ボーセン

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SKA、SCO、NS、BHJ、DEB が設計し、SKA、SCO、NS、JJE、RBS が実験を実施しました。 NS、SKA、および TB は EM データを収集しました。 NS は、JLK の支援を受けて解像度を下げるために Phn(GH​​IJ)2K の初期 EM 構造を決定しました。一方、SKA はすべての高解像度構造を決定し、構造の改良と検証を実行しました。 SKA と DEB が原稿草稿を書き、図を作成し、著者全員がテキストを修正しました。

Ditlev E. Brodersen への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Andrew Hitchcock と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

アムストラップ、SK、オング、SC、ソフォス、N. 他二重ABC ATPアーゼによる炭素リンリアーゼ機構の構造再構築。 Nat Commun 14、1001 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36604-y

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受信日: 2022 年 5 月 3 日

受理日: 2023 年 2 月 8 日

公開日: 2023 年 2 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36604-y

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