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May 31, 2023

環境ループの開発

parassiti e vettori

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 78 (2023) この記事を引用

988 アクセス

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

世界的な変化により、これまで風土病ではなかった地域にベクターが拡散し、ベクター媒介疾患の分布が再構築されています。 2013年以来、コルシカ島で泌尿生殖器住血吸虫症が発生し、ヨーロッパ諸国を脅かしています。 腹足類媒介動物は住血吸虫幼虫を放ち、淡水域と接触した人間に感染する可能性があります。 住血吸虫症の宿主ベクターを監視することは、この病原体伝播を理解し、その後制御するための前提条件です。 病気の調査は時間がかかり、特別な専門知識が必要なため、単純な分子法の使用が望ましいです。

この研究の目的は、LAMP (ループ媒介等温増幅) 法を使用して、住血吸虫のベクターである Bulinus truncatus の環境 DNA を検出するためのすぐに使えるプロトコルを開発することです。 興味深いことに、LAMP 法は、速度、単純さ、凍結乾燥試薬、低コスト、DNA 増幅阻害剤に対する堅牢性など、特に低所得国の現場条件への適応に必要なすべての特性を備えています。 私たちは、以前に qPCR および ddPCR によって分析されたコルシカ島の水サンプルでこの新しい方法をテストしました。

我々は、診断ツール B. truncatus eLAMP (Bt-eLAMP) が、他の 2 つの方法と同様に Bulinus truncatus の eDNA を効果的に検出できることを実証します。 Bt-eLAMP は、qPCR では検出できない陽性サンプルの 1/4 も検出できます。 さらに、完全な Bt-eLAMP プロトコル (サンプリング、サンプルの前処理、増幅、および暴露) は高度な機器を必要とせず、1 時間半で実行できます。

環境 DNA の LAMP 検出は、潜在的に脅威にさらされている領域を特定することにより、泌尿生殖器住血吸虫症の大規模な高感度監視を可能にします。 より一般的には、eLAMP 法はベクター媒介疾患および生態学において大きな可能性を秘めています。

世界的な変化が感染症の流行のリスクを高めることは十分に確立されています[1、2、3]。 豚インフルエンザのパンデミック、西アフリカでの多数のエボラウイルスの流行、2015年のジカウイルスの流行、そして新型コロナウイルス感染症のパンデミックなど、過去10年間に続いた流行の波はすべて、複数の国に広がりながら、重大な死亡率と罹患率をもたらした[2]。 人間や動物におけるベクター媒介疾患の発生率は、気候変動や人間のライフスタイル（移住、汚染、都市化など）の影響を受けます[1、4、5]。 ここ数年、それらの多くは世界中で出現または再出現しています。 たとえば、ダニ媒介脳炎ウイルスの地理的範囲とヒトの発生率は、フランスを含むヨーロッパ全土で、以前は風土病ではなかった地域で増加しています[6]。 住血吸虫症は貧困と家庭における飲料水の不足に関連する病気ですが、住血吸虫感染は南ヨーロッパ（フランスとスペイン）で確認されています[7、8]。 腹足類媒介動物は住血吸虫幼虫を放ち、淡水域と接触した人間に感染する可能性があります。 2013年の夏、観光地として知られるフランスの地中海の島、コルシカ島で106人以上の感染者が診断された[9、10]。 それ以来、少数の自家感染の症例が毎年続いています[11]。 多くの寄生虫病では、地球規模の変化により、病気を伝播するベクターまたは中間宿主の空間的再分布が生じ、病気の出現につながる可能性もあります[12、13、14、15、16]。 感染症の発生地域をマッピングすることは、感染の危険にさらされている人々を特定し、一般の人々に伝達および警告するために不可欠です[17]。 ベクター媒介疾患に関しては、伝播はベクターの存在に依存するため、疾病の制御にはベクターの空間分布をマッピングすることが必要です。 いくつかのアフリカ諸国では、カタツムリ駆除キャンペーンがカタツムリ媒介疾患（SBD）の制御に大きな役割を果たしており、軟体動物駆除剤の定期的な散布がリスクのある地域でのSBDの撲滅におそらく貢献していることが示されている[18,19,20]。 ]。 しかし、SBD、特に淡水巻貝種を介して伝播するSBDの監視は、あまり明らかではありません。 淡水軟体動物の分布の空間的および時間的不均一性は、これらのリスクマップを確立することの難しさを説明しています[21、22]。 したがって、従来のサンプリング方法は手間と時間がかかり、分類学的な同定には腫瘍学者が必要ですが、近年、分子生物学の普及に伴いその人材はますます不足しています。 したがって、現在、大規模な空間的および時間的スケールでカタツムリの個体数を監視することは非常に困難です[21、22]。

この問題に対処するために、環境 DNA (eDNA) に基づいて、SBD のモニタリングを簡素化するツールの開発が検討されてきました [23]。 eDNA 増幅法は、ヒトスジシマカなどの多くの寄生虫ベクターを検出するために開発されました [24]。また、Galba truncatula や Austropeplea tomentosa などのカタツムリ宿主も検出するために開発されました [25、26]。どちらの種も肝吸虫 (Fasciola hepatica) の伝染に関与しています。 eDNA の検出は通常、定量的 PCR DNA 増幅技術を使用して行われます。 より最近では、それぞれ日本住血吸虫とヘマトビウム住血吸虫の感染に関与するオンコメラニア・フペンシスとブリヌス・トランカトゥスのeDNA検出が、定量的PCR（qPCR）またはデジタルドロップレットPCR（ddPCR）のいずれかによって可能になりました[21、27]。 これらの最後の研究で得られた結果は、高感度および特異性の検出を示しました。 ddPCR による B. truncatus eDNA の検出により、最大 0.06 コピー/μl まで検出できました [21]。 これは、SBD モニタリングを簡素化するツールの開発における大幅な進歩を表しています。 しかし、これらの技術はすべて、サンプル調製（つまり、PCR 阻害剤を使用せずに eDNA を取得するための高価で時間のかかる DNA 抽出キットの使用）と増幅装置（つまり、LightCycle または ddPCR）の両方に高度で高価な装置を必要とします。 これらの高価な技術には設備の整った研究室が必要ですが、住血吸虫の流行地域ではほとんど利用できません。 カタツムリの分布図を実現するための、費用対効果が高く現場に適応したツールの開発が依然として必要です [17、23、28]。 ループ媒介等温増幅 (LAMP) 技術は、これを可能にする可能性を秘めています [29、30、31]。 興味深いことに、LAMP 法は、速度、単純さ、凍結乾燥試薬、低コスト、DNA 増幅阻害剤に対する堅牢性など、特に低所得国における現場条件への適応に必要なすべての特性を備えています [29、30、32]。 実際、鎖置換活性を持つ Bst ポリメラーゼ酵素と、標的配列の 6 ～ 8 領域にハイブリダイズする 4 ～ 6 個のプライマーを使用すると、DNA 二本鎖を事前に変性させることなく、一定温度で指数関数的 DNA 増幅反応を実行できます。 実際、プライマーのハイブリダイゼーションにより、新たに増幅された鎖上にステムループ構造が形成され、新たな増幅開始ゾーンの数が指数関数的に増加します。 最終的に、電気泳動ゲルによる顕示後にはしごを形成する、さまざまなサイズのいくつかの断片で構成される塗抹標本が得られます。 したがって、反応は単純な加熱ブロック内で約 63 °C の一定温度で非常に迅速に (通常は 1 時間未満) 行われます [29、31、33]。 LAMP の実行には大型または高価な機器は必要ないため、最近の研究では、サンプリング現場にできるだけ近い現場診断を実行するためのポータブルデバイスの開発に焦点が当てられています [34,35,36,37]。 阻害剤に対する耐性により、DNA を精製するための DNA 抽出キットを必要とせず、非常に簡素化された前処理でサンプルに対して実行できます。これは現場でも行うことができます [38、39]。 DNA 増幅は、裸眼視覚化、ゲル電気泳動、またはリアルタイム蛍光によって検出でき、現場設定での使用の柔軟性を提供します [34、36]。 最近の研究では、LAMP によって eDNA を検出できることが示されています [40,41,42,43]。 環境 LAMP (eLAMP) は、高度な実験器具や高度な訓練を受けた人員を必要とせずに、水中の糞便指標細菌の存在を 1 時間で検出できるように開発されました [40]。 2 つのチームは、LAMP を使用して水サンプルから軟体動物の eDNA (Galba truncatula および Dreissena sp.) を増幅することに成功しました [41, 42]。

この研究の目的は、住血吸虫の中間宿主である Bulinus truncatus の環境 DNA を検出するための迅速診断 LAMP ツールを開発することです。 住血吸虫症はマラリアに次いで 2 番目に多い寄生虫症であり、依然として無視された熱帯病です。 発生率が高いにもかかわらず(年間2億3,000万人の感染者と20万人の死亡者[44])、カタツムリ駆除キャンペーンを実施する取り組みは非常に少ない[28、45、46]。 しかし、2017年にWHOは、進歩を維持するためにカタツムリの防除に再び焦点を当てるよう呼びかけ、加盟国に対し、住血吸虫症を含む媒介生物媒介疾患の発生率を2025年までに少なくとも40%削減することを目標として、国内の媒介生物防除戦略を開発または適応するよう求めた。 [46]。 したがって、この病気には、カタツムリの分布を迅速にマッピングするための費用対効果が高く、現場に適したツールが必要です[23]。 qPCR または ddPCR 増幅法と比較して、eLAMP は低所得国での現場適用に有利であると考えられます。 ただし、DNA 抽出キットを使用する場合のように、増幅に先立つ DNA 抽出プロトコルが現場の条件に適合していない場合、この利点は失われます。 私たちの研究は、(i) B. truncatus 特異的 eLAMP アッセイの開発、(ii) eDNA バンク上の LAMP によって得られた結果と qPCR および ddPCR によって得られた結果との比較、および (iii) 完全な現場向けプロトコルの開発で構成されていました。検出の。

Bulinus truncatus eLAMP (Bt-eLAMP) 診断ツールは、環境 DNA (eDNA) バンクと軟体動物から新たに抽出された DNA の両方から開発されました。

eDNA バンクは、フランスのコルシカ島で以前に収集された 200 のサンプルで構成されています [21]。 これらのサンプルは、コルシカ島南部の 2 つの異なる川で収集された水濾過膜から抽出された DNA でした。 最近、泌尿生殖器住血吸虫症の伝播がこれら 2 つの河川で証明されています [9、10、47]。 川の海岸と川底の両方から 3 つの異なる量の水 (1、3、5 リットル) を収集しました。 チャヴ川では、ムリヌ橋とチロリアナ公園の場所 (重複してサンプリング)、B. truncatus が存在する 3 つのプールの場所、および B. truncatus が存在しない取水場所の 4 つの場所でサンプリングされました。 B. truncatus が存在する Solenzara 川から 1 つの場所がサンプリングされました。 ネガティブコントロールは、川沿いの純粋な湧き水を濾過することによって作成されました。 コルシカ島のこれらのサンプリング場所に加えて、ネガティブコントロールとして、B. truncatus が記録されたことのないペルピニャン大学のキャンパス内の人工チャネルからも eDNA がサンプリングされました。 得られた水濾過膜からの eDNA 抽出プロトコルは以前に説明されています [21] が、ここで簡単に思い出します。各濾過膜を 4 等分に分割し、DNeasy® Blood & Tissue Kit (QIAGEN) を使用して抽出しました。 200 個のサンプルから、B. truncatus が存在する場合は 144 個の eDNA サンプルが収集され、B. truncatus が存在しない場合は 56 個の eDNA サンプルが収集され、それらは qPCR を使用して増幅されました。 少なくとも 4 分の 1 の膜が陽性であれば、サンプルは陽性とみなされます。 ddPCR 反応は、各膜の 4 等分からの DNA 抽出物のプールで実行されました (つまり、50 反応) [21]。 qPCR と ddPCR の両方で得られた膜ごとの結果を eLAMP (本研究) と比較しました。 qPCR によって得られた膜の 4 分の 1 あたりの結果も eLAMP と比較されました。

eDNA に加えて、プライマー セットの特異性をテストするために、組織抽出プロトコルに従って DNeasy® Blood & Tissue Kit (QIAGEN) を使用して淡水巻貝 (Bulinus sp. およびその他の系統学的に関連する属) からの DNA も抽出しました。 簡単に説明すると、各カタツムリを粉砕した後、サンプルを Speedvac™ DNA 130 (Savant™、Thermo Scientific™) に 65 °C で 20 分間入れ、残留アルコールまたは水分を除去しました。 次にカタツムリを、20 mlのプロテ​​イナーゼKと180 mlのATL緩衝液を含む溶液中で56℃で4時間溶解させた。 残りのステップは、製造元の指示に従って実行されました。 DNA 濃度は、Qubit® 2.0 蛍光光度計を使用して測定されました。 これらの最後の DNA を超純水で希釈して、最終濃度 0.5 ng/μl を得ました。 得られた DNA 抽出物と希釈液は、使用するまで -20 °C で保存しました。

DNA ターゲットの選択は、eLAMP 診断ツールの開発における成功の可能性を最大化するために徹底的に行われました。 ITS2; 5,8S; 18S; COI; および 28S B. truncatus DNA 領域は GenBank データベース (NCBI、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/; アクセッション番号: 5,8S については MH361757; 18S については KJ157340 [48]; については KJ157370) からダウンロードされました。 28S [48]、COI の場合は MT707426 [49]、ITS2 の場合は MG757890 [50])。 入手可能な場合は、他の Bulinus 種の配列を GenBank データベースからダウンロードして、B. truncatus 固有の検出ツールを開発しました。 プライマーセットの設計は、Primer Explorer V5 ソフトウェア (栄研化学株式会社; http://primerexplorer.jp/e/) を使用して、「LAMP プライマー設計ガイド」 (https://www.cisco.com/en/US/products/ps2016/) に記載されている基準に従って実施しました。 ://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html）。 セットは次のパラメーターを満たす必要があります。各プライマーの長さは 18 ～ 22 bp です。 F1c/B1c ペアの Tm は 64 ～ 67 °C。 F2/B2 および F3/B3 ペアの Tm は 59 ～ 62 °C。 GC 率は 50 ～ 65%。 5' および 3' 安定性の場合は dG 閾値 < –4 kcal/mol、二量体チェックの場合は 0 ～ –1 kcal/mol。 プライマーダイマーの推定と各プライマーセットの安定性は、「Multiple Primer Analyzer」（Thermo Scientific Web ツール）および OligoAnalyzer™ ツール（IDT™）を使用してオンラインでチェックされました。 選択したすべてのプライマーは、Eurogentec (Seraing、ベルギー) によって合成されました。

設計されたプライマーセットごとに、増幅反応パラメーター (すなわち、MgSO4、プライマーおよびベタイン濃度、反応時間および温度) を調整することにより、いくつかの増幅アッセイを実行しました。 選択したプロトコールは次のとおりです: 1.2 μM の内部プライマー FIP および BIP、0.2 μM の外部プライマー F3 および B3、0.4 μM の LOOP プライマー LB および LF、1.0 mM の各 dNTP ( New England Biolabs)、1X 等温増幅バッファー II 反応バッファー [20 mM Tris-HCl、10 mM (NH4)2SO4、150 mM KCl、2 mM MgSO4、0.1% Tween® 20、pH 8.8@25 °C (New England Biolabs、英国)]、3 mM 追加 MgSO4 (New England Biolabs、英国)、1.2 M ベタインおよび 1 U の Bst 2.0 WarmStart DNA ポリメラーゼ (New England Biolabs、英国)、および 2.5 μl DNA テンプレート。 反応直後に結果が視覚化されない場合は、反応チューブをバッテリー駆動の加熱ブロックに 63 °C で 45 分間置き、続いて 80 °C で 5 分間酵素不活化段階を設けました。 結果の視覚化は、LAMP DNA 増幅で古典的に使用されているさまざまなプロトコルに従って行われました: (i) 1:50 に希釈した 10,000 倍濃度の SYBR Green (Invitrogen) 2 μl を添加した後の蛍光の最終点視覚検出 (緑色: 陽性、オレンジ: 陰性) ); (ii) 50 ml アガロースゲルに対して 2 μl MIDORI Green Advance (日本ジェネティクス) を用いた 2% アガロースゲル電気泳動での LAMP 産物の最終点視覚検出 (UV によって明らかに)。 (iii) 反応混合物にSybr-Green 0.25xを組み込み、Genie IIIポータブルデバイス(Optigene Ltd)で増幅をモニタリングすることによるリアルタイム検出。

設計されたすべてのプライマーセットの特異性は、同じ属で異なる種の 4 つの標本 (すなわち、B. forskalii、B. globosus、B. umbilicatus、および B. senegalensis) を含む 12 種の淡水カタツムリ種 (表 1) の DNA テンプレートで評価されました。および他の系統発生的に関連した属。 5 つの異なる産地 (表 1) からの Bulinus trucatus を評価して、種内変動の可能性を視覚化しました。 B. truncatus DNA のみを増幅するプライマー セットのみを次の実験のために保持しました。

検出限界（LOD）は、LOOP プライマーを反応液に添加する前後に、10 ng/μl から 1.10 ～ 9 ng/μl まで 10 倍段階希釈した B. truncatus 由来の DNA に対する LAMP アッセイによって評価されました。 得られた検出限界 DNA 濃度から、次の方程式を使用して、マイクロリットルあたりの B. truncatus ターゲット コピー数を推定しました。

ここで、Nc = マイクロリットルあたりの B. truncatus ターゲット コピーの数。 C = 検出限界 DNA 濃度 (ng/μl)。 V = 体積 (ここでは 1 μl); M = 窒素含有塩基の平均モル質量 = 309 g/mol; Sg = B. truncatus ゲノムサイズ = 1.2.109 pb; NA = アボガドロ数; NrDNA = ゲノム内の平均 rDNA コピー数 = 93 コピー [51,52,53,54,55,56]。

当社は、LAMP の現場でのメリットを最大限に活用できる、現場で使いやすい新しい eDNA 濃縮プロトコルを開発しました。 水は、水域の表面にある清潔な市販のプラスチックボトルに集められます。 次に、0.45 µm 濾過ユニット (PES VWR 1L 514-0301) と手動ポンプを使用して、500 ml ～ 1500 ml の水を川に沿って濾過します。 水は、堆積物の堆積により膜が詰まるまで濾過されます。 メンブレンをメスの刃で 4 等分に切断し、15 ml 溶解バッファー [100 mM NaCl、250 mM EDTA、5% SDS および 10 mM Tris-HCl (pH = 8)] を含む 1 本の 25 ml Falcon™ チューブに入れます。 ]。 濾過ユニットから膜を取り外すために使用されるクランプは、各サンプリングの前に、10% 漂白剤浴に 15 秒間、次に DNA AWAY™ 溶液 (Thermo Scientific) に 15 秒間連続して配置することによって汚染除去されます。 激しく撹拌した後、液体を 20 ml シリンジで収集します。 液体を 40 µm の膜で事前濾過して大きな沈殿物を除去し、次に 0.45 µm (13 mm) Whatman® GD/XP シリンジ フィルター (PTFE Sigma Aldrich WHA69742504) で濾過します。 最後のフィルターを 5 ml の蒸留水で洗浄し、同体積の空気で乾燥させます。 eDNA は、円錐形の 18 GA 分注針 (Metcal) と結合したシリンジを使用して、500 μl の超純水で逆濾過することによって最終的に回収されます。

この最後のプロトコルは、2022 年 7 月に調査されたセネガルの 2 つの水域で評価されました。ランプサール遺跡 (北緯 16 度 06 分 29 秒、西経 16 度 20 分 59 秒) とディアマ遺跡 (北緯 16 度 12 分 36 秒、西経 16 度 20 分 59 秒) です。西経16度24分10秒）は両方ともセネガルのサンルイ地域のセネガル川沿いに位置しています。 各サイトで、水サンプルはサンプリング間隔が約 10 分で 3 回採取されました。 ランプサールとディアマのサイトでは、それぞれ 700 ミリリットル、500 ml の 2 倍、500 ml の 3 倍が収集されました。 各部位において、生物学的サンプルの場合と同じ手順に厳密に従い、1500 ml の純粋な湧き水を濾過することによって陰性対照を実施した。 B. truncatus の現場での存在は、2 人の軟体動物学者が 1 時間かけて軟体動物をサンプリングすることによって確認されました。

新たに開発されたLAMPで得られた結果と、200フィールドのeDNAライブラリー上のB. truncatus DNAの検出のためのqPCRとの間の一致は、Rソフトウェアのpsychパッケージ（バージョン2.2.9）を使用してカッパ係数分析を計算して統計的に分析されました。 eDNA バンクのフィールド感度は、R ソフトウェアの統計パッケージ (バージョン 3.6.2) を使用して 95% 信頼区間で計算されました。

合計 18 のプライマー セットを設計しました。 パラメーターの調整、感度および特異性の評価後、ITS2" マーカーを標的とする最良の候補を選択しました (表 2)。追加ファイルには、ITS2 配列上のプライマー アラインメントが示されています (追加ファイル 1 を参照)。これに対するプライマー ダイマーの最小 dG設定値は -0.93 kcal/mol でした。

Bt-eLAMP の特異性は、異なる産地からの 11 の非標的種と 5 つの標的軟体動物から抽出された DNA をテストすることによって評価されました。 図 1a は、5 つの B. truncatus DNA サンプルのみが増幅されていることを示しています。 感度テスト (図 1b) は、完全なプライマーセット (LOOP プライマーを含む) を使用した場合、LOD が 1 fg/μl (つまり、1 マイクロリットルあたり約 Nc = 0.07 コピーに相当) であることを示しています。 LOOP プライマーを添加する前の検出限界は 1 pg/µl でした。

Bulinus truncatus eLAMP (Bt-eLAMP) アッセイの特異性と LOD (検出限界)。 45 分間の反応後にアガロースゲル電気泳動で得られた結果。 特異性; レーン 1 ～ 5、5 つの異なる産地 (ディアマ、ランプサール、ムバネ、コルシカ島、サネインテ) からの Bulinus truncatus DNA テンプレート。 レーン6、Bulinus globosus。 レーン 7、Bulinus senegalensis。 レーン8、ブリヌス・フォルスカルリ。 レーン9、Bulinus umbilicatus。 レーン 10、Biomphalaria glabrata。 レーン 11、Bithynia tentaculata。 レーン12、アンシルス・フルヴィアティリス。 レーン13、Gyraulus laevis。 レーン 14、Physa acuta。 レーン15、Potamopyrgus antipodarum。 レーン 16、Pisidium casertanum。 レーン C + 、ポジティブコントロール (Bulinus truncatus DNA; 1 ng)。 レーン C-、ネガティブコントロール (テンプレートとして水)。 b LOD。 レーン 1 ～ 11、Bulinus truncatus DNA 10 倍段階希釈 (10 ng/μL ～ 1 ag/μl)。 レーン C-、ネガティブコントロール (テンプレートとして水)

図 2 は、コルシカ島の 2 つの川から収集された eDNA サンプルに対する LAMP、qPCR、および ddPCR 増幅法の間の検出精度の比較を示しています。 Bt-eLAMP 法では、qPCR および ddPCR を使用して得られた結果と同じ結果が得られました。 Mulinu ブリッジ 2 サイトの「1LStreambed」膜を除き、すべての膜が陽性です。 6 つのフィールド陰性対照、B. truncatus が発生しなかった大学の施設、または B. truncatus が収集されなかったチャヴ川からの取水場所で収集されたサンプルからは、陽性シグナルは検出されませんでした (図 2)。 B. truncatus が存在する膜の 4 分の 1 ごとに得られた結果を考慮すると、144 サンプル中 110 サンプルが LAMP で正常に増幅されました。 一方、144 サンプル中 91 サンプルが qPCR で正常に増幅されました。 LAMP 法の感度は 76.4% (95% CI 68.6 ～ 83.1)、qPCR 法の感度は 63.2% (95% CI 54.8 ～ 71.1) と推定されました。 これらの結果から得られたカッパ一致は 0.51 に等しくなります (表 3)。

ループ媒介等温増幅 (LAMP)、定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR)、および液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応 (ddPCR) 増幅法による Bulinus truncatus 環境 DNA 検出の比較。 各セルは、コルシカ島の 2 つの川 (チャヴ川とソレンザラ川) およびペルピニャン海峡で収集された eDNA からの DNA 増幅結果を表します。 Bulinus truncatus カタツムリは、チャヴ川の取水場所とペルピニャン海峡の大学敷地を除くすべての場所に存在します。 コルシカ島のすべての場所で、川の海岸と川底の両方から 3 容量の水 (1、3、5 リットル) が収集されました。 各線は、LAMP、qPCR、または ddPCR 増幅法を使用した各部位からの増幅結果を表します。 qPCR および ddPCR の結果は Mulero らから得られます。 [21]。 緑色の膜は、濾過膜の少なくとも 4 分の 1 が Bulinus truncatus の存在に関して陽性であることを意味し、赤色の膜は、濾過膜の 4 分の 1 も陽性でないことを意味します。 空のセルは、これらの条件下でろ過が行われていないことを意味します

現場で使いやすい検出方法としての LAMP 増幅の使用は、水域に沿って実行できる新しい eDNA 濃縮プロトコルを開発することによって改善されました。 プロトコル全体はセネガルのランプサールとディアマのサイトでテストされました。 これら 2 つのサイトでは、2 人のマラカス専門医によって 1 時間のサンプリングでそれぞれ 95 匹と 229 匹の B. truncatus がサンプリングされました。 ランプサール遺跡から採取された 95 匹の B. truncatus のうち 4 匹は、2 時間光にさらされた後にセルカリアを放出しました。 Bulinus globosus は両方の部位に存在しました。 Bulinus forskalii は Diama サイトでのみ存在し、Biomphalaria pfeifferi はランプサールサイトでのみ見つかりました。 2 つのサイトからの 3 つの eDNA サンプリングは陽性であり (図 3)、この方法の精度が 100% であることを示しています。 ネガティブコントロールはいずれもポジティブではありませんでした。 B. truncatus eDNA のサンプルは、ポジティブ コントロール (B. truncatus 抽出 DNA) の増幅後、平均 12 分で増幅されました。

セネガルのディアマ (a) およびランプサール (b) 遺跡における Bulinus truncatus 環境 DNA のリアルタイムループ媒介等温増幅。 オレンジ、黄色、緑の線はテスト済みのサンプルです。 青緑色と青色の線は陽性対照です (1 ng の B. truncatus 抽出 DNA)。 赤い線はフィールド陰性サンプル (1500 ml のミネラルウォーター濾過) です。 紫とピンクの線は実験室の陰性サンプル (超純水)

世界的な変化により、これまで風土病ではなかった地域にベクターが拡散し、ベクター媒介疾患の分布が再構築されています。 したがって、ベクトル分布マップ用のコスト効率が高く現場に適応したツールの開発が必要です [17、28]。 本研究では、熱帯寄生虫 (S. haematobium) を媒介する淡水巻貝 (B. truncatus) の環境 DNA を検出するための迅速 LAMP 診断ツールを開発しました。 当社の Bt-eLAMP は、63 °C で 45 分間インキュベートした後、B. truncatus の ITS2 DNA マーカー画分を増幅することに成功しました。 in vitro アッセイでは、LOOP プライマーを含む場合、Bt-eLAMP の LOD が 1 fg/μl に等しい高感度であることが証明されました。 LOOP プライマーを添加する前の LOD が 1 pg/µl であったことを考慮すると、LOOP プライマーの添加により感度が 1000 倍向上すると推測されます。方法論的な観点から、これは、 LOOPプライマーを含む。 開発された LAMP 技術の検出限界は、一般に 100 ～ 0.1 fg/µl です [43、57、58、59]。 私たちの LOD は、蛭症の淡水巻貝ベクター (Galba truncatula) の LAMP eDNA 検出について以前に評価された LOD と比較して低いです [41]。 これらの最後の著者らは、0.349 pg/μl の LOD を測定しました [41]。 完全なプライマーセット（つまり、LOOP プライマーを含む）を使用してコピー数の同等性（マイクロリットルあたり 0.07 コピー）を推定すると、ddPCR を使用して得られる感度（マイクロリットルあたり 0.06 コピー）に近い感度が得られました [21]。 当社の Bt-eLAMP は、すべての DNA 増幅技術の中で最も感度が高いと考えられている ddPCR と比較して同等の感度を示しました [60、61]。

当社の Bt-eLAMP アッセイは、近縁のカタツムリ種を考慮した場合でも、B. truncatus に対して 100% の特異性を示しました。 これは、Bt-eLAMP アッセイが、他のカタツムリが共生する領域で交差反応性のリスクなしに B. truncatus eDNA を検出できるほど堅牢であることを示唆しています。 私たちのツールを使用すると、B. truncatus と、形態学的に区別できない B. globosus などの他の Bulinus 種との間の種判定も可能になります。 一方で、B. globosus などの一部の軟体動物の姉妹種も泌尿生殖器住血吸虫症の伝播に関与している可能性があることを考慮すると、この高い特異性の有用性が疑問視される可能性があります [62]。 B. truncatus と B. globosus の両方、または Bulinus 属のすべての種の汎特異的検出を可能にする eDNA 診断ツールを開発することも興味深いでしょう。 困難は、Bulinus 種間で十分に保存された領域と、他の腹足類とは十分に異なる領域の間の平衡を見つけて、属特異的なプライマーセットを取得することです。 この最後の作業は、LAMP で必要なプライマーの数と、ターゲット配列上でプライマー間の位置の制約により、これらの要件を満たす配列の長さが増加するため、より困難になります。

私たちの eDNA バンクを考慮すると、Bt-eLAMP 法は、qPCR または ddPCR と比較してまったく同じ全体的な検出能力を提供しました [21]。 各膜の四半期を考慮すると、LAMP または qPCR を使用した場合、それぞれ 76.4% (95% CI 68.6 ～ 83.1) および 63.2% (95% CI 54.8 ～ 71.1) の陽性検出率であり、LAMP 法は qPCR と比較してより高い検出能力を示しました [21] 。 カッパ係数は、2 つの方法間の適度な一致を強調しています。 15 の膜の 4 分の 1 は LAMP では陰性ですが、qPCR では陽性です。 逆に、34 の膜の 4 分の 1 は qPCR では陰性であり、LAMP では陽性です。 PCR 阻害剤の存在により、これらの最後の結果が説明される可能性があります。 実際、qPCR とは対照的に、LAMP は阻害剤に対して強いことがすでに証明されています [29、63]。

LAMP などの現場で使いやすい増幅法の開発には、現場で使いやすいサンプルの前処理の開発を伴う必要があります。 DNA抽出キットは精製度が高いため収量が低く、遠心分離機などの特殊な装置が必要であり、高価です。 したがって、私たちは eDNA を濃縮するための、現場に優しい新しい水サンプル前処理を開発しました。 サンプリングと前処理プロトコルは、電気のない現場で 45 分で完了しました。これは、SBD モニタリングにおける大幅な進歩を表しています。 それにもかかわらず、特に水の濾過ステップにおいて、プロトコルにいくつかの改善を加えることができます。 わずか 500 ml の水を濾過するのにサンプルあたり 30 分かかるため、使用する手動ポンプではプロトコルの速度と利便性が制限されます。 水中の吸虫を対象とした DNA 調査では、適合したフィルター カプセルと組み合わせた 12 V バッテリー駆動のダイヤフラム ウォーター ポンプを使用して、最大 50 リットルの水をろ過しました [64]。 Bt-eLAMP アッセイの実用性と速度をさらに高めるために、改良された電池式ポンプを手動ポンプに置き換えることができます。 電動ポンプとプロトコルで使用されるフィルターユニットの間の互換性をテストする必要があります。

私たちは Genie III を使用してセネガルからフィールド結果を取得しました。これは、反応速度論の視覚化を可能にする、便利で持ち運びが容易なバッテリー駆動のフィールド ツールです。 凍結乾燥試薬と組み合わせることで、このタイプのポータブルデバイスを使用すると、プロトコル全体（サンプリング、前処理、増幅、および暴露）を現場で実行できるようになります[32]。 Genie III の使用が経済的な障害となる可能性がある低所得国では、別のポータブル デバイスを使用する必要があります。 新型コロナウイルス感染症の世界的なパンデミックには、低コストで現場に優しい LAMP を実行するためのいくつかのツールの開発が関係していました [34、35、65、66、67]。 Genie III と同じ方法でリアルタイムの増幅と蛍光読み取りを可能にする、低コストのオープンソース LAMP 診断デバイスが開発されました [34]。 LAMP 反応は、「T カップ」と呼ばれる相変化材料が充填されたコーヒー カプセルを使用して行うことができ、沸騰水中で 63 °C でのインキュベーションが可能で、肉眼でも確認できることが証明されています [35]。 別の研究では、スマートフォン ベースの LAMP の発現ステップは、蛍光読み取りを可能にするフィルターと組み合わせたスマートフォン アプリケーションを使用して評価できました。 将来的には、現在の LAMP 検査を凍結乾燥試薬とこのタイプの装置で改良し、大量のサンプルで検査する必要があります。

この研究では、環境中の吸虫の中間宿主であるカタツムリ B. truncatus DNA の存在を検出する、完全なフィールドフレンドリーな LAMP アッセイを開発しました。 現場で使いやすく、前処理サンプルを費用対効果の高い方法で採取できるという LAMP の利点により、Bt-eLAMP 検査は、泌尿生殖器住血吸虫症の再発リスク マップを迅速かつ効率的に確立するための貴重な新しいツールとなる可能性があります。 eLAMP は、処理中の廃水中の腸内寄生虫の存在を検出するためにも使用されており、住血吸虫属を探す可能性も提供しています。 eDNA を直接使用します [68]。 住血吸虫の伝播の原因となる他のブリヌス属またはビオンファラリア属の種に対して eLAMP を開発する必要があるでしょう。 eLAMP は、住血吸虫症と同じ診断圧力を持つ他の SBD に対しても開発される可能性があります。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事に含まれています。

カタツムリが媒介する病気

ループ媒介等温増幅

環境ループ媒介等温増幅

ポリメラーゼ連鎖反応

定量的ポリメラーゼ連鎖反応

液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応

環境DNA

検出限界

ポジティブコントロール

ネガティブコントロール

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野外で環境 DNA サンプルを収集するのに協力してくれた Alassane Ndiaye に特に感謝します。 インターンシップ中にプロジェクトに取り組み、追加の LOOP プライマーを設計した Celia Robin に感謝します。

この研究は、フランス食品環境労働安全衛生庁（PNRES 2019/1/059 Molrisk）とオクシタニー地域（Schistodiag プログラム）の資金提供を受けました。 この研究は、ANR「Investissements d'avenir」プログラム (ANR-10-LABX-04-01) である LabEx CeMEB の支援を受け、「Laboratoires d'Excellences (LABEX)」TULIP の枠組み内で実施されました ( ANR-10LABX-41)。

ホスト病原体環境相互作用、UMR 5244、CNRS、IFREMER、UM、ペルピニャン大学、Via Domitia、66860、ペルピニャン、フランス

マノン・ブリン、ジェローム・ボワシエ、スティーヴン・ムレロ、オリヴィエ・レイ

SAS ParaDev®、66860、ペルピニャン、フランス

マノン・ブリン & ジュリアン・ポルテラ

VITROME、IRD-UCAD インターナショナル キャンパス、1386、ダカール、セネガル

ブルーノ・サンゴール

大学グルノーブル アルプ大学サヴォワ モンブラン、CNRS-LECA、38000、グルノーブル、フランス

スティーブン・ムレロ

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JP、JB、OR、MB が最初のアイデアを考案し、研究を設計しました。 MB は、Bt-eLAMP アッセイの研究室開発を実施しました。 JB、BS、MBはフィールドサンプリングを実施しました。 JB と BS は病気の専門知識を提供しました。 SMはeDNAバンクを提供した。 JB、JP、MB はデータを分析し、解釈しました。 JB と MB が原稿を書きました。 BS、JB、SM、OR、JP、MB が原稿を改訂しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

マノン・ブリンまたはジュリアン・ポルテラへの通信。

適用できない。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

ITS2 マーカーに対する Bt-eLAMP プライマーのアラインメント (アクセッション番号: MG757890)。 各矢印はプライマーを表します。 緑色の陰影はプライマーハイブリダイゼーションの方向を表します (濃い緑色: 前方、薄緑色: 後方)。

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転載と許可

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受信日: 2022 年 11 月 24 日

受理日: 2023 年 2 月 15 日

公開日: 2023 年 2 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05705-4

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