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Nov 11, 2023

分子アトラスが明らかにするトリ

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 837 (2023) この記事を引用

3973 アクセス

253 オルトメトリック

メトリクスの詳細

クモの大アンプル腺 (Ma) 腺における天然シルクの生産プロセスにより、引き綱シルクに並外れた機械的特性と生体模倣用途の可能性が与えられます。 しかし、この過程におけるマ腺の正確な遺伝的役割は不明のままです。 今回我々は、金色の球体を織るクモ Trichonephila clavata の高品質ゲノムアセンブリと、Ma 腺の 3 つのセクション構造 (尾、嚢、管) を定義するマルチオミクス アプローチを通じて、引き綱シルク生産の系統的な分子アトラスを作成しました。 私たちは、細い絹の構成に特化した区分化されたマ腺におけるスピドロイン、有機酸、脂質、キチンの階層的生合成を発見しました。 スピドロインの秩序ある分泌は、ゲノムグループに分布するスピドロイン遺伝子のエピジェネティックなサインとceRNAサインの相乗制御によって達成されました。 単細胞RNAプロファイリングおよび空間RNAプロファイリングにより、Ma腺の3セクション構成を決定する分割された機能分裂を持つ10種類の細胞が同定された。 収束解析と遺伝子操作により、この絹糸腺の 3 つに分かれた構造が節足動物全体で類似しており、絹糸の形成と密接に関連していることがさらに検証されました。 まとめると、私たちの研究は、クモの引き綱シルク生成に関する知識を大幅に拡大し、最終的にはクモからインスピレーションを得た繊維の革新に役立つ多次元データを提供します。

クモ (クモ目) は、5 万種以上の現存種を含む、豊富に存在する一般的な節足動物です。 すべてのクモは、クモの生存と繁殖に不可欠な天然の高性能タンパク性繊維である糸を生産します 3,4。 絹の生産は、特に経済的に興味深い魅力的なクモの顕著な特性であり、これは主に、高い引張強度と靭性、低密度、自家動力による回転作動、生体適合性など、これらの繊維の優れた特性によるものです5、6、7。 多くの研究者が、クモの糸のような特性を持つ人工材料を生体模倣的に生成するために、天然のスピドロイン (クモの糸の主要なタンパク質) の生産および紡糸プロセスをエミュレートしようと試みてきました。 しかし、クモの糸の形成に関する現在の理解の多くは、その性質の部分的な像しか提供していない物理的および材料的研究に基づいています12、13。 したがって、天然の絹糸生産システムに関与する分子生物学的機構の解明は、クモの糸の深い理解を得る上で価値がある14、15、16、17。

オーブウェブスパイダーには複数の絹糸生産腺がありますが、大膨大部 (Ma) 腺は、その比較的大きなサイズと、特にその製品である引き綱絹糸の優れた特性により、絹糸生産研究のモデル系としてよく使用されます 18。 したがって、牽引糸シルクからインスピレーションを得た繊維を革新するほとんどの試みは、一般に、Ma 腺によって生成されるシルクタンパク質と微小環境に関係しています 11、12、19。 Ma 腺は、尾、嚢、管の 3 つの巨視的セグメントに分けることができ、これらは pH 値、イオン濃度、せん断力の勾配によって特徴付けられます 20、21、22。 液体のシルクタンパク質は尾と嚢で合成され、非常に高濃度で貯蔵され、管を介して不溶性繊維に変換されます23,24。

これに関連して、強度、伸長性、粘着性などのシルクの特定の物理的特性を達成するために、組換え大アンプルレートスピドロイン (MaSps) が構築されています 25,26,27。 非スピドロインタンパク質であるスパイダーシルク構成要素（SpiCE）は、複合シルクフィルムの場合の引張強度を高めるために利用されています28、29。 さらに、自然のイオンおよび pH 条件を厳密にシミュレートするように設計されたマイクロ流体デバイスにより、繊維を出口から直接引き出し、自然紡糸のように空気中に巻き取ることが可能になりました 30,31,32。 Ma 腺の細胞構造と分子機能、および牽引索シルクの生組成と形成を含む、牽引索シルク生産の根底にある詳細なメカニズムが、高度な繊維革新の基礎であることが明らかになりつつあります 11,33。

これらのメカニズムを明らかにするために、我々はここで、カラフルな体を示し、大きくて印象的な球巣を構築する金色の球体ウェブスパイダー Trichonephila clavata の高品質な染色体スケールの参照ゲノムを提示します（図 1a）。 Ma 腺と牽引糸シルクのマルチオーム解析により、Ma 腺セグメント (尾、嚢、管) からの牽引糸シルク成分の起源を追跡し、スピドロイン遺伝子のエピジェネティックなおよび転写後の調節機能を解明し、単一の遺伝子を構築しました。 -三分割Ma腺の細胞空間構造。これは、セグメント特異的、細胞型特異的、空間特異的、および引き綱シルク関連遺伝子発現分類にのみ基づいた、クモMa腺の最初の詳細な細胞学的定義を提供する。 これらの結果により、3 つに分かれた Ma 腺内での天然シルク生産の包括的な分子アトラスを作成することができ、引き綱シルクの生成機構が解明されました。 データはさらに拡張されて、別の節足動物グループのモデル種であるカイコカイコにおける絹生産の収束進化を明らかにし、クモとカイコの絹糸腺の共通の分子特性を示しました。 私たちのマルチオミクス データセットは SpiderDB (https://spider.bioinfotoolkits.net) でアクセスでき、シルク生産戦略の進化的起源の将来の探求や生体模倣スパイダー シルクの作成にとって価値があります。

a 金色の球体ウェブ上の成人女性と成人男性を示す T. clavata の写真 (上)、および女性と男性の核型 (下)。 SCS、性染色体システム。 b 13の偽染色体のゲノムランドスケープを示す円形図（MbスケールのChr1〜13）。 c 染色体上に固定された 28 個の T. clavata スピドロイン遺伝子。 d 別の球状蜘蛛、T. antipodiana のスピドロイン遺伝子群。 T. antipodiana35 の公開されたゲノム データを分析して、スピドロイン遺伝子の位置情報を特定しました。 e 6 種の球状蜘蛛の Spidroin 遺伝子カタログ。 f 絹糸腺（大および小アンプル腺（Ma および Mi）、鞭毛腺（Fl）、尿細管腺（Tu）、凝集腺（Ag）、および腺房腺および梨状腺（Ac および Py）腺）および毒腺の発現クラスター化。 ピンクの線は、マ腺とミ腺の間の最も密接な関係を示しています。 g T. clavata 絹糸腺の形態。 同様の結果が 3 つの独立した実験で得られ、ソース データにまとめられています。 h さまざまな種類の絹糸腺における 28 個のスピドロイン遺伝子の発現パターン。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

T. clavata における引き綱シルク生産を調査するために、我々はこの種の高品質のゲノムを構築しようとしました。 そこで、我々はまず、中国雲南省大理市で野生から捕獲したT. clavataの細胞遺伝学的分析を行ったところ、女性では2n = 26、男性では2n = 24の染色体相補体が見つかりました。これは11対の常染色体要素と、対になっていない性染色体（女性ではX1X1X2X2、男性ではX1X2）（図1a）。 次に、成体の T. clavata からの DNA を使用して、ロングリード (オックスフォード ナノポア テクノロジーズ (ONT))、ショートリード (イルミナ)、および Hi-C データ (補足データ 1) を生成しました。 合計 349.95 Gb の Nanopore リード、199.55 Gb の Illumina リード、および約 438.41 Gb の Hi-C 生データが生成されました。 私たちの逐次アセンブリアプローチ（補足図1c）により、202.09 Mbの足場N50と93.70％のベンチマークユニバーサルシングルコピーオルソログ（BUSCO）ゲノム完全性スコアを備えた2.63 Gbのゲノムが得られました（表1;補足データ3）。 最終的に、ゲノムは 13 個の偽染色体に組み立てられました。 クモの性特異的なPool-Seq分析により、Chr12とChr13が性染色体であることが示されました（図1b、補足図2）。 MAKER2パイプライン34（補足図1e）に基づいて、37,607個のタンパク質をコードする遺伝子モデルに注釈を付け、ゲノムの53.94％を占める合計長1.42Gbの反復要素を予測しました。

T. clavata スピドロイン遺伝子を特定するために、443 個の公表されたスピドロインに類似した配列の注釈付き遺伝子モデルを検索し (補足​​データ 6)、分類のために推定スピドロイン配列の系統解析を実行しました (補足図 12a)。 典型的なスピドロイン遺伝子は非反復 N/C 末端ドメインに挟まれた長い反復ドメインで構成されているという知識に基づいて 16、128 個の非反復ヒットが主に同定されました。 これらの候補は、全長転写物アイソフォーム シーケンス (Iso-seq) およびトランスクリプトーム シーケンス (RNA-seq) データを使用してさらに検証され、再構築されました。 したがって、我々は28個のスピドロイン遺伝子を同定し、そのうち26個は全長であり（補足図11a）、9個のMaSp、5個の小アンプル状スピドロイン（MiSps）、2個の鞭毛状スピドロイン（FlSps）、1個の管状スピドロイン（TuSp）、2個の集合体スピドロインを含む。 (AgSp)、1 つの腺房状スピドロイン (AcSp)、1 つの梨状スピドロイン (PySp)、および 5 つのその他のスピドロイン。 このスピドロイン遺伝子の完全なセットは、13 本の T. clavata 染色体のうち 9 本にまたがって位置していました。 興味深いことに、MaSp1a–cおよびMaSp2e、MaSp2a–d、およびMiSp-a–e遺伝子がそれぞれ染色体4、7、および6上の3つの独立したグループに分布していることがわかりました（図1c）。 特に、別のオーブウィーグモ種であるTrichonephila antipodiana35のゲノムデータを使用して、T. antipodiana染色体上のスピドロイン遺伝子の相同グループ分布を特定しました（図1d）。これは、私たちの研究のグループ化結果の信頼性を示しました。 T. clavata のスピドロイン遺伝子カタログと他の 5 種類のクモ類のスピドロイン遺伝子カタログをゲノムデータと比較したところ、T. clavata と Trichonephila clavipes が最も多くのスピドロイン遺伝子 (28 遺伝子) を保有していることがわかりました。両方の種で;図1e)。

さまざまな腺におけるスピドロイン遺伝子の発現をさらに調査するために、形態学的に異なるすべての腺 (大および小アンプル腺 (Ma および Mi)、鞭毛状腺 (Fl)、管状腺 (Tu)、および凝集腺 (Ag) 腺) をきれいに検査しました。腺房状腺と梨状腺を除いて、雌の T. clavata 成体クモから別々に解剖されました。腺房状腺と梨状腺は解剖学的に近位にあるため、きれいに分離できなかったため、複合サンプル (腺房状腺と梨状腺 (Ac および Py)) として処理しました。 これらの絹糸腺のRNA配列決定後、トランスクリプトームデータの発現クラスタリング分析を実行したところ、Ma腺とMi腺が形態学的構造（図1g）と遺伝子発現（図1f、h）の両方の点で最も密接な関係を示すことがわかりました。 我々は、スピドロイン遺伝子の発現プロファイルが、対応する形態学的に異なる絹糸腺における推定上の役割とほぼ一致していることに注目した。 たとえば、MaSp の発現は Ma 腺で見つかりました (図 1h)。 ただし、MiSpsやTuSpなどの一部のスピドロイン転写物は、いくつかの絹糸腺で発現されました（図1h）。 Sp-GP-richなどの未分類のスピドロイン遺伝子は、腺特異的な発現を示さないようでした（図1h）。

要約すると、T. clavata の染色体スケールのゲノムにより、この種のすべてのスピドロイン遺伝子の詳細な構造および位置情報を得ることができました。 また、T. clavata では比較的多様なスピドロイン遺伝子セットと MaSp および MiSp のグループ化された分布も発見されました。

Ma 腺を介した引き綱シルクの分泌の詳細な分子特性をさらに評価するために、3 つの T. clavata Ma 腺セグメントのトランスクリプトームと T. clavata 引き綱シルクのプロテオームおよびメタボロームの統合分析を実行しました（図 2a）。 。 ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による引き綱シルクの分析では、主に240 kDaを超える太いバンドが示され、総タンパク質の種類が比較的少ないことが示唆されました（図2b）。 その後の液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS) 分析により、10 種類のスピドロイン (9 種類の MaSp と 1 種類の MiSp) と 18 種類の非スピドロインタンパク質 (1 種類のグルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)、1 種類のムチン-19、1 種類の毒タンパク質、および 15 種類の SpiCE) を含む 28 種類のタンパク質が同定されました。ドラッグラインシルク（SpiCE-DS）の）（図2b;補足データ10）。 これらのタンパク質のうち、ドラッグラインシルクのコアタンパク質成分は、強度ベースの絶対定量（iBAQ）パーセンテージの順にMaSp1c（37.7％）、MaSp1b（12.2％）、SpiCE-DS1（11.9％、別名SpiCE-DS1）であることがわかりました。以前の研究では SpiCE-NMa1 28)、MaSp1a (10.4%)、および MaSp 様 (7.2%) であり、引き綱シルクの総タンパク質存在量の約 80% を占めています (図 2b)。 これらの結果は、引き綱シルクの優れた強度および靭性と高度に相関している可能性のある潜在的なタンパク質成分を明らかにしました。

Ma 腺セグメンテーションの概略図。 b ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）（左）および牽引糸シルクタンパク質のLC-MS（右）分析。 iBAQ、強度ベースの絶対定量化。 同様の結果が 3 つの独立した実験で得られ、ソース データにまとめられています。 c 引き綱シルクで同定された代謝産物の分類。 d 代謝産物の LC-MS 分析。 e T. clavata 引き綱シルクからの黄金抽出物の LC-MS 分析。 金色の顔料を 80% メタノールで抽出しました。 抽出イオンクロマトグラム (EIC) では、キサンツレン酸の m/z 206 [M + H]+ のピークが示されました。 f さまざまな Ma 腺セグメント (尾、嚢、管) のピアソン相関。 g 尾部、嚢、および管の発現クラスタリング。 トランスクリプトーム データは、階層クラスタリング (HC) 法に従ってクラスター化されました。 h 尾、嚢、および管における引き綱シルク遺伝子の発現プロファイルを示すトランスクリプトームとプロテオームの組み合わせ分析。 i T. clavata Ma 腺におけるキサンツレン酸の簡潔な生合成経路 (トリプトファン代謝)。 トリプトファン代謝にマッピングされた遺伝子発現レベルが、Ma 腺の 3 つのセグメントで示されています。 経路に関与する酵素は赤色で示され、その酵素をコードする遺伝子はその横に示されます。 j 尾、嚢、および管の生物学的機能を示す Ma 腺セグメント特異的遺伝子の遺伝子オントロジー (GO) 濃縮分析。 有意に豊富な上位 12 の GO 用語が、Ma 腺の各セグメントについて示されています。 有意に豊富なGO用語をスクリーニングするための基準として、P値<0.05を設定しました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

T. clavata 引き綱シルクの組成を評価するために、次にその代謝産物組成を評価し、合計 180 の成分を特定しました (補足データ 12)。 代謝産物のうち、109 個は 10 のカテゴリーに分類されました。内訳は、有機酸 34 個、有機複素環式化合物 22 個、脂質 16 個、ベンゼノイド 13 個、有機窒素 5 個、有機酸素 8 個、ヌクレオシド 5 個、有機酸素 3 個、フェニルプロパノイドおよびポリケチド 2 個、およびアルカロイド 1 個でした。 2c; 補足データ 13)。 キサンツレン酸 (XA、黄色色素 38) が最も豊富な色素であることに注目しました (図 2d)。一方、他の黄色色素 (カロテノイドやフラボノイド 39,40 など) は分析では検出されず、XA が主要な色素であることを示唆しています。 T. clavata の引き綱シルクに黄金色を与えます。 XA の存在は、最近の報告と一致して、LC-MS 分析によってさらに確認されました (図 2e)。

3 つに分かれた Ma 腺からの引き綱シルク成分の起源を探るために、我々は尾、嚢、管のトランスクリプトーム特徴に焦点を当てました。 我々は、尾部と嚢の遺伝子発現プロファイルが管の遺伝子発現プロファイルよりも互いにより高い相関があることを決定し（図2f、g;補足図13c）、これは尾部と嚢が同様の分子機能を持っていることを示唆しています。 さらに、トランスクリプトーム解析とプロテオーム解析を組み合わせた結果、尾、嚢、および管における28の引き綱シルクタンパク質転写物の発現パターンが明らかになりました（図2h;補足データ10）。 注目すべきことに、MaSp1a ～ c​​ および MaSp2e (MaSp-Group1) は尾部と嚢で高度に共発現され、MaSp2a ～ d (MaSp-Group2) は嚢でのみ高度に共発現されましたが、これらのタンパク質グループはいずれも尾部と嚢で高度に共発現されませんでした。これは、尾部と嚢が主要な絹糸分泌セグメントであることを示しています。

次に、3 セクションの Ma 腺データセットを使用して、代謝産物 XA の供給源を追跡しました。 XA生合成（トリプトファン代謝）経路に関与する主要な酵素をコードする遺伝子が、3つのMa腺セグメントすべてで活性化されていることを発見しました（図2i）。 特に、3-ヒドロキシ-L-キヌレニン（3-HK）のXAへのアミノ基転移を触媒する一次酵素をコードするキヌレニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子（KAT、Tc09G169510）がこのパターンを示した。 これらの発見は、XA が尾、嚢、および管から分泌されることを示唆しました。

引き綱シルクの生産に関連する尾、嚢、および管の特定の生物学的機能を特徴付けるために、次に、Ma腺セグメント特異的遺伝子の機能を分類するために遺伝子オントロジー（GO）用語を割り当てました（補足データ14）。 我々は、（管および嚢と比較して）尾部で有意に豊富なGO用語は主に有機酸（絹メタボロームの最大のグループ）の合成に関連し、嚢内のそれらは（管および嚢と比較して）有機酸の合成に関連していることを発見した。尾部）は主に脂質の合成（絹メタボロームで 3 番目に大きいグループ）に関係し、管内の脂質（嚢および尾部に比べて）はイオン（Ca2+ および H+）交換とキチン合成に関係していました（図） .2j）。 このようにして、生物学的機能の部分的な分割が明らかになった。

まとめると、我々の結果は、Ma 腺における引き綱シルクの 3 つの部分の生成プロセスを示しています。 したがって、我々は、引き綱のシルク成分と尾腺、嚢腺、管腺との遺伝的関係を確立しました。

Ma 腺の RNA 配列データに基づいて、引き綱絹糸遺伝子の 100 万マッピングリードあたりの転写産物の 1 キロベースあたりの総フラグメント (FPKM) が、それぞれ尾と嚢の FPKM 値の 47.49% と 34.33% を占めていることがわかりました。 ; しかし、ダクトでは、これらの遺伝子はFPKM値の0.76％のみを占め（補足データ11）、引き綱シルク遺伝子の転写が最初の2つのセグメントで信じられないほど効率的であることを示しています。 特に、2つのグループ内のMaSpは、Ma腺の特定のセグメントで高度に共発現されました（図2h）。 これらの発見により、引き綱シルク遺伝子のセグメント特異的な発現パターンが明らかになりました。

これらの遺伝子の転写制御モードをより深く理解するために、我々はまず、トランスポザーゼがアクセス可能なクロマチン配列決定アッセイ（ATAC-seq）を使用して、尾、嚢、および管におけるゲノム全体のクロマチンアクセス可能性（CA）を調査しました。 合計 702,037 (尾部)、767,517 (Sac)、および 653,361 (ダクト) の有意な ATAC ピーク (RPKM > 2) が遺伝子の上流および下流の 2 kb 領域で同定され、10,501,151 (尾部)、11,356,55 (Sac) )、および 9,778,368 (ダクト) の有意な ATAC ピーク (RPKM > 2) が全ゲノム レベルで同定されました。 Tail（平均RPKM：1.78）およびSac（平均RPKM：2.04）プロットは、Duct（平均RPKM：1.59）プロットよりもアクセスしやすいクロマチンを持つ遺伝子を示しました（図3a）。 次に、尾、嚢、管におけるゲノム全体の DNA メチル化レベルを分析しました。 我々は、CG コンテキストで最も高いレベルの DNA メチル化 (ベータ値: 尾部で 0.12、嚢で 0.13、および管で 0.10) を発見しましたが、CHH ではほんの少量 (ベータ値: 尾部で 0.04、嚢で 0.05、および管で 0.10) のみでした。管内0.03）およびCHG（ベータ値：尾部0.04、嚢内0.05、管内0.04）コンテキスト（図3b）。 全体として、尾、嚢、管の間でメチル化レベルに有意な差はありませんでした。 総合すると、我々の結果は、牽引糸シルク遺伝子の転写におけるDNAメチル化ではなく、CAの潜在的な調節的役割を示唆している。

ATAC-seq シグナルの Metagene プロットと、尾、嚢、および管における ATAC-seq 読み取り密度のヒートマップ。 クロマチンへのアクセス可能性は、平均 RPKM 値 (上) と青色の領域 (下) によって示されました。 b 尾、嚢、および管のCG / CHG / CHHコンテキストにおけるDNAメチル化レベルのメタジーンプロット。 (c、d) 尾部、嚢、および管内の MaSp1b (c) および MaSp2b (d) 遺伝子のメチル化および ATAC-seq トラックのスクリーンショット。 示されたピークセット (TSS の 2 kb 上流) 内の潜在的な TF モチーフ (E 値 <1e-10) が右側にリストされ、位置によって並べ替えられます。 アスタリスクは、対応する MaSp グループ内で共有される TF モチーフを表します。 e MaSp-Group1 と MaSp-Group2 の間の TF モチーフのベン ネットワーク。 f 尾、嚢、および管における miRNA および lncRNA の発現レベル。 日付は平均値 ± SD (各 Ma セグメントの n = 3) として表示されます。 箱ひげ図は、すべてのデータ ポイントの最小値から最大値 (ひげ)、25 ～ 75% (ボックス)、中央値 (内側のバンド) を示します。 g 引き綱シルク遺伝子の ceRNA ネットワーク。

次に、ゲノムブラウザで2つのMaSpグループのATAC-seqおよびメチル化データセットを視覚化すると、ピークシグナルの逆傾向が明らかになりました（図3c、d;補足図16）。 転写開始部位 (TSS) の上流 2 kb 領域にある ATAC-seq ピーク セットの中の潜在的な TF モチーフを分析しました。 MaSp1b（MaSpグループ1）の9つの尾部およびSac特異的TFモチーフと、MaSp2b（MaSpグループ2）の13のSac特異的TFモチーフを同定しました（補足データ15;補足図17a、b）。 興味深いことに、MaSpグループ1のMYBおよびホメオボックスモチーフ、MaSpグループ2の2つのC2H2モチーフなど、TSSに最も近いTFモチーフが各MaSpグループ内で共有されていたことに注目しました（図3c、d）。 ただし、MaSp-Group1とMaSp-Group2の間のTFモチーフのベンネットワークは、尾部、嚢、および管の間でほとんど共通性を示しませんでした（図3e）。 したがって、我々は、各 MaSp グループ内には共通の制御パターンが存在するが、2 つの MaSp グループ間では区別された制御パターンが存在すると結論付けました。

牽引糸シルク遺伝子の制御に対応する競合する内在性 RNA (ceRNA: miRNA と lncRNA42 によって実現される転写後制御システム) の影響を調査するために、我々は 3 セクションの Ma 腺の全トランスクリプトーム解析を実行し、合計527のmiRNA（尾に179、嚢に167、管に181）および10,110のlncRNA（尾に240、嚢に982、管に4808）（図3f）。 これらのデータから、miRanda43 および RNAhybrid44 アルゴリズムを使用して潜在的な lncRNA-miRNA-mRNA 相互作用ペアを構築し、miRNA と lncRNA/mRNA 間の潜在的な結合部位を特定し、Cytoscape ソフトウェア 45 を使用して相互作用ネットワークを視覚化しました。 図3gに示すように、引き綱シルク遺伝子のceRNAネットワークは、28のlncRNA、21のmiRNA、および13のmRNAで構成されていました。 注目すべきことに、MaSp1a ～ c​​ および MaSp2e (MaSp グループ 1) の ceRNA ネットワークは、MaSp2a ～ d (MaSp グループ 2) のネットワークと同様に密にクラスター化されていることがわかりました。 MaSp-グループ1ネットワーク内の3つのlncRNA（LXLOC_047988、LXLOC_047990、およびLXLOC_051464）は、Ma腺で高度に発現されました（補足図18）。 MaSp-グループ2ネットワーク内の1つのlncRNA（LXLOC_070389）と4つのmiRNA（novel_mir42、novel_mir46、novel_mir166、およびmiR-285_3）は、Ma腺で高度に発現されました（補足図18）。 さらに、2つのMaSpグループのceRNAネットワークは互いに独立していました（図3g、補足図18）。 これらの結果は、潜在的な転写後ネットワークと、Ma 腺の 2 つの MaSp グループにおける遺伝子の分化した共調節パターンをさらに明らかにしました。

要約すると、本発明者らは、牽引糸シルク遺伝子の効率的かつセグメント特異的な転写に関連する豊富なエピジェネティックなおよびceRNAサインを観察した。 我々のデータは、MaSpの階層的遺伝子発現の達成に特化したMa腺の3つの部分に異なる制御戦略が存在することを示唆しました。

Ma 腺の階層的組織に関連する細胞学的基礎をさらに調査するために、T. clavata 全体の Ma 腺における遺伝子発現の単一細胞および空間パターンを生成しました。 品質管理後に合計 9349 個の高品質の単一セル (SC) が得られ、均一多様体近似および射影 (UMAP) クラスタリングによって 10 個のクラスターに分割されました (図 4a)。 各クラスターのセグメント特異的遺伝子の発現プロファイルと組み合わせたクラスター特異的マーカー遺伝子のGO分析に基づいて（補足図21および補足注記「細胞型アノテーション」）、10個のSCクラスターの詳細なアノテーションを実行しました。即ち、クラスター１：Ma腺起点細胞（MaGO）、クラスター２：MaSp-Group合成細胞（MG1S）、クラスター３：キチン合成細胞（CS）、クラスター４：未知細胞、クラスター５：膨大管腔骨格細胞（ ALS)、クラスター 6: イオン輸送細胞 (IT)、クラスター 7: 脂質合成細胞 (LS)、クラスター 8: pH 調整細胞 (PA)、クラスター 9: MaSp-グループ 2 合成細胞 I (MG2S I)、およびクラスター10: MaSp グループ 2 合成細胞 II (MG2S II)、尾部 (クラスター 1 および 2)、嚢 (クラスター 1、2、5、7、9、10)、および管 (クラスター 1、 3、4、6、8）（図4a）。

Ma 腺の細胞型とそれらの 10 個の細胞クラスターへのグループ化の均一多様体近似および投影 (UMAP) 分析。 白塗りの丸内の数字は細胞塊を示します。 ユビキタスクラスターは黄色のシリーズで、嚢クラスターは緑色のシリーズで、管クラスターは青色のシリーズで示されています。 b すべての 9349 Ma 腺細胞の擬時間軌跡。 各ドットは単一のセルを示し、(a) のようにクラスターごとに色分けされています。 黒塗りの丸内の数字は分岐部位を示します。 黒い矢印は軌道の開始点を示します。 c Ma 腺切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色および空間トランスクリプトーム (ST) スポットの不偏クラスタリング。 点線は Ma 腺の輪郭を示しています。 同様の結果が 3 つの独立した実験で得られ、ソース データにまとめられています。 d UMAP および ST は、MaSp グループにおける遺伝子発現のプロットを特徴としています。 e 各細胞型および各 ST クラスターにおける Ma 腺セグメント特異的遺伝子の発現を、対応する GO 用語とともに示すヒートマップ。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

Ma 腺内で尾、嚢、管がどのように発達するかを識別するために、擬時間に従ってすべての単一細胞を順序付けし、発達の軌跡を構築しました。 これにより、3 つの異なる分岐点を持つセルの連続体が得られました。 我々は、クラスター 1 (ユビキタス SC クラスター) の細胞のセットが擬似時間期間の開始時に集合し、Ma 腺の 2 つのセグメント (嚢と管) を表す 4 つの終点に徐々に分岐し、クラスターが次の位置に配置されることを発見しました。異なる分岐部位（図4b）。 さらに、尾、嚢、管の発達の軌跡を個別に調査しました。 予想通り、クラスター 1 のほとんどの細胞は擬似時間の開始時に集合しましたが、Sac 細胞 (クラスター 2、5、7、9、10) と Duct 細胞 (クラスター 3、4、6、8) は異なるブランチにグループ化されます（図4b、補足図23）。 これらの結果は、SC クラスター 1 が Ma 腺起源細胞であることを特定し、細胞状態遷移中の Ma 腺細胞の分化軌跡についての洞察を提供しました。

次に、Ma 腺セクションの細胞集団の空間構成を評価しました。 このデータセットには、Ma 腺切片内の 579 個の空間トランスクリプトーム (ST) スポットにわたって生成されたリソースからの遺伝子発現情報が含まれていました (図 4c)。 ST スポットの転写サインを分析した後、7 つのスポット クラスター (尾に 1 つ、嚢に 4 つ、管に 2 つ) を特定しました。 Ma 腺における単細胞および空間的遺伝子発現パターンの最初の実証として、UMAP および ST 特徴プロットで MaSp-Group1 および MaSp-Group2 遺伝子の発現を視覚化し、捕捉したシルクタンパク質分泌細胞の位置をより正確に特定しました。細胞集団。 興味深いことに、MaSp-Group1 遺伝子は Tail クラスターと Sac クラスター (SC クラスター 1、2、5、7、9、10 および ST クラスター「a ～ f」) で顕著に発現しているのに対し、MaSp-Group2 遺伝子は顕著に発現していることがわかりました。は、主にSacクラスター（SCクラスター9〜10およびSTクラスター「d」）で発現されました（図4d;補足図22a）。 したがって、遺伝子は、scRNA-seq結果とST結果の両方に従って、発現および制御分析の結果と一致する細胞および空間クラスター特異的パターンを示しました（図2h、3c、d、g）。

Ma 腺の分子機能に関連する同定された SC および ST クラスターの特徴を明らかにするために、セグメント トランスクリプトームで同定されたセグメント特異的遺伝子 35 個を選択し、scRNA-seq および ST データセットに基づいて発現解析を実行しました。 我々は、SCクラスター2とSTクラスターaが有機酸代謝過程と酸化還元酵素活性の機能をもつ主要なセットであることを発見した。 SC クラスター 7 と ST クラスター "e" は、脂質代謝プロセスとトランスフェラーゼ活性の機能を持つ主要なセットでした。 SC クラスター 6 と ST クラスター "f" は、カルシウムイオン結合機能を持つ主要なセットです。 SC クラスター 3/8 と ST クラスター「c/g」は、プロトン輸送 V 型 ATPase 複合体の機能を持つ主要なセットです。 そして、SCクラスター3とSTクラスター「f」は、キチン結合の機能を持つ主要なセットでした（図4e;補足図25、26）。

要約すると、Ma 腺の詳細な解剖学的および分子的説明により、尾部内の単一の細胞型と嚢および管内の複数の細胞型が明らかになり、3 つのセクションにおける Ma 腺の発生および機能の分化が強調されました。

絹を紡ぐための特殊な腺も進化させた確立されたモデル生物に研究を拡張するために、節足動物門のクモとは系統発生学的に異なる位置を持つカイコ、カイコを選択しました46。 解剖学的観察を通じて、T. clavata Ma 腺 (尾、嚢、管) と B. mori 絹糸腺 (後部絹糸腺 (PSG)、中部絹糸腺 (MSG) の間の絹紡糸腺の形態学的収束に注目しました。 ）、および前絹糸腺（ASG））、3つのセクションの構造が1対1で対応していることを示しています（図5a、b）。 また、T. clavataとB. mori47の間で同様の数の絹糸腺細胞型が見つかりましたが、管/ASGのキチン関連プロセスを除いて注釈が区別されました（図5b、補足図29）。 我々のこれまでの研究では、PSG と ASG の構造的欠陥によって引き起こされるカイコによる絹糸紡績の欠陥が明らかになりました 48,49。 しかし、クモの遺伝子操作システムはまだ確立されていません。 カイコ絹糸腺の残りの部分が適切な絹糸生産に必要かどうかを調べるために、蝶の細胞毒素 (ピエリシン-1A、P1A50) の ser1 プロモーター駆動トランスジェニック過剰発現 (OE) を使用して、MSG 欠損カイコ (P1A- OE）（図5c）。 我々は、P1A-OE系統のMSGが首尾よく切断され、これらのカイコが繭を紡ぐことができないことを発見した（図5c）。これは、PSGおよびASG欠損カイコの表現型と一致している48,49。 我々の結果はさらに、絹糸腺の三部分構造が絹紡糸に不可欠であることを実証した。

a T. clavata Ma 腺、引き綱シルク、B. mori シルク腺、および繭シルクの形態。 挿入図は絹糸の断面を示しています。 同様の結果が 3 つの独立した実験で得られ、ソース データにまとめられています。 b 尾、嚢、管が示されているT.クラバタMa腺（上）と、PSG、MSG、およびASGが示されているB.モリ絹糸腺（下）の形態的収束を示す概略図。 c piggyBacトランスジェニックベクターの構築（上）、およびカイコのP1A-OEおよび野生型（WT）株の絹糸腺表現型（下）。 Ser1-P、Ser1 プロモーター。 3 × P3-P、3 × P3 プロモーター。 SV40-T、SV40ターミネータ。 L5D7 は 5 齢の 7 日目を表します。 矢印はシルクの生産プロセスを示し、赤い十字はプロセスがブロックされたことを示します。 d クモおよびカイコにおけるオルソロガス Hsp20 タンパク質 (Tc04G175120 および BMSK0007630) の配列アラインメント。 赤い線は編集領域を示します。 矢印は、sgRNA の切断部位の周囲で同定された対立遺伝子の分布を示しています。 割合の高い上位 16 配列を表示しました。 e CRISPR / Cas9ベースのHsp20ノックアウトカイコ株の繭重量、蛹重量、および繭層速度のパフォーマンス。 データは平均±SD (n = 3) として表されました。 統計的比較は両側スチューデント t 検定を使用して行われました。 ns は有意でないことを示します。 **P 値 <0.01。 矢印はシルクの製造工程を示しています。 横棒で終わる赤い線は、プロセスが抑制されたことを示します。 f GO 用語分析による T. clavata Ma 腺と B. mori 絹糸腺の分子機能の収束。 有意に豊富なGO用語をスクリーニングするための基準として、P値<0.05を設定しました。 g T. clavata Ma 腺と B. mori 絹糸腺の間のオルソロガスな遺伝子発現の収束。 h、i T. clavata と B. mori によって生産されたシルク間のタンパク質 (h) と代謝産物 (i) の成分収束。 総強度パーセンテージが 90% を超える代謝物が分析されました。 T. clavata 引き綱シルクおよび B. mori 繭シルクの主要な代謝産物は赤色で示されています。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

これら 2 種間の収束をさらに調査するために、全ゲノム blastp アラインメントを実行し、T. clavata と B. mori でそれぞれ 9593 個と 7355 個のオルソロガス遺伝子を同定しました。 これらの割り当てられた遺伝子オルソログペアから、T. clavata と B. mori の間で 87.1% という高い配列同一性があるため、Hsp20 ペア (Tc04G175120 および BMSK0007630) を選択しました (図 5d)。 さらに、Hsp20は、T. clavataとB. moriの両方の絹糸腺で発現され、同時に小さな熱ショックタンパク質をコードするT. clavata Ma腺のSCクラスター5のマーカー遺伝子としても機能しました（補足データ17）。これは、他のタンパク質をミスフォールディングや凝集から保護するタンパク質シャペロンとして機能します51。 次に、カイコでCRISPR / Cas9ベースのHsp20ノックアウト（KO）を実行し、Hsp20 sgRNAの標的部位でインデル（96.46％）を特定することに成功しました（図5d）。 興味深いことに、Hsp20-KO株のシルク生産量（繭重量および繭層率）が野生型のものよりも大幅に低いことがわかりました（図5e）。 これらの結果から、我々は、調査したクモとカイコの両方において、オルソロガスな Hsp20 がシルク生産に積極的な役割を果たしていると結論付けました。

クモとカイコの収斂進化の証拠についてシルクの紡糸の分子的特徴をさらに調査するために、次に、T. clavata と B. mori の 3 つの部分からなる絹糸腺とシルクの比較トランスクリプトーム、プロテオミクス、メタボローム分析を実行しました。 共通の GO タームが、T. clavata と B. mori の対応する各絹糸腺領域間で同定されました。 3つのGOターム（カルシウムイオン結合、キチン結合、およびシグナル伝達）が管およびASGで一般的に豊富であり、1つのGOターム（脂肪酸代謝プロセス）が一般的にSacおよびMSGで豊富であることがわかりました（図5f）。 。 これらの共有GO用語は絹糸腺特異的であり、他の組織タイプ（血球および卵巣）では同定されませんでした（補足図30）。 次に、カスタマイズされたパイプラインを使用して、各絹糸腺セグメントに対して独自の遺伝子スクリーニングを実行しました（補足図28a）。 我々は、42、6、および2対のオルソロガス遺伝子が、それぞれ管とASG、嚢とMSG、尾部とPSGで共発現していることを発見した（図5g;補足データ20）。 興味深いことに、シルク原線維形成の制御に関与する重要な因子をコードするV型ATPアーゼファミリーに関与する7つのオルソログ遺伝子ペア52が、管とASGの両方で有意に上方制御されていることを発見しました（図5g）。 我々の結果は、嚢とMSGまたは尾部とPSGの間よりも、ダクトとASGの間の分子機能におけるより高い一貫性を示した。

次に、2つの種にわたるシルクプロテオームとメタボロームのベン分析を実行することにより、クモとカイコのシルクの成分が収束を示すかどうかを調査しました（補足図28b）。 私たちは、ムチン-19とGDHが、T. clavataの引き綱シルクとB. moriの繭シルクの両方に存在する唯一の2つのタンパク質であることを発見しました。そしてより興味深いことに、これらのタンパク質は主にTail/PSGおよびSac/MSGによって合成され、分泌されていました（図1）。 5時間）。 また、これら 2 つのシルクに含まれる 6 つの一般的な代謝産物、コリン、N-メチル-α-アミノイソ酪酸、DL-リンゴ酸、D(-)-トレオース、4-オキソプロリン、L-トレオン酸も同定しました（図5i）。 これらの代謝産物の中で、細胞膜のリン脂質の成分であるコリン 53 と、防腐剤または pH 調整剤 54 として機能する DL-リンゴ酸が両方とも引き綱シルクと繭シルクの主要な代謝産物であることは注目に値します（図 5i）。 。 したがって、腺細胞から内腔への絹の分泌には細胞膜からのコリン放出が伴い、天然絹にはDL-リンゴ酸によって防腐性と抗菌性の特性が与えられると我々は推測した。

要約すると、クモとカイコの 3 つに分かれた絹糸腺の共通の分子特性は、絹糸紡績に関連する同様のケースでの収束進化を示し、絹糸腺の機能と絹生合成についての豊富な洞察を提供しました。

ここでは、T. clavata の最初の染色体スケールの参照ゲノム アセンブリを報告します。 この高品質のゲノムとマルチオミクス解析を組み合わせることで、3 つに分かれた Ma 腺における絹糸生合成プロセスの解明が可能になりました。 私たちの発見は、尾がMaSps分泌において主な機能を果たしているのに対し、嚢は貯蔵部位として機能し、広範囲のタンパク質（MaSpsおよび非スピドロインタンパク質）を分泌し、管はタンパク質分泌において限定的な役割を果たしているという仮説を立てました。しかし、タンパク質の構造遷移において重要な役割を果たします20、21、24。

我々は、T. clavata Ma 腺における引き綱シルク生合成の基礎となるメカニズムを包括的に説明する分子モデルを提案します (図 6): (i) 2 つの遍在する細胞タイプからなる尾部は、有機酸の分泌の主要な部位であり、引き綱シルクの内層を構成する13個の引き綱シルクタンパク質。 有機酸の存在は、立体構造状態を変化させることによって、水へのタンパク質の溶解度に影響を与える可能性があります55。 尾部では、これら 13 の引き綱シルク遺伝子が高度に活性化されており、その中で MaSp グループ 1 タンパク質をコードする転写物が主要な構成要素となっています。 このセグメントの比較的高い CA は、mCG メチル化とともに、この豊富な遺伝子発現に寄与している可能性があります。 (ii) 嚢は、2 つの遍在性細胞型と 4 つの固有の細胞型からなり、脂質と、牽引糸シルクの中間層を構成する 28 個の牽引糸シルクタンパク質の分泌の主要な部位です。 脂質は、引き綱シルクの周囲を包み込み、その水分含有量を調節するコートとして機能します55。 これら 28 の引き綱シルク遺伝子も嚢内で高度に活性化されており、その中で MaSp-Group1、MaSp-Group2、MaSp 様、SpiCE-DS1、SpiCE-DS2、SpiCE-DS4、および SpiCE-DS13 が主要な構成要素です。 比較的高い CA および mCG メチル化も、このセグメントで観察される高い遺伝子発現に寄与している可能性があります。 (iii) 管は、1 つの遍在性細胞タイプと 4 つの固有の細胞タイプで構成され、キチン、クチクラタンパク質、イオン (Ca2+ および H+)、および 13 の引き綱シルクタンパク質の分泌の主要な部位です。 キチンとクチクラタンパク質はクチクラ内膜を形成し、そこでせん断力が発生します21,56。 イオンは、イオン交換、pH 勾配の形成、脱水などの多次元的なフラックス状態に関与しており 11,20、13 個の引き綱シルクタンパク質が引き綱シルクの外層を構成しています。 引き綱シルク遺伝子の転写は、尾部や嚢よりも管での活性が低く、これらの遺伝子からの転写は 0.76% のみです。 このセグメントの CA が比較的低いことと、mCG メチル化がこの発現低下に寄与している可能性があります。 全体として、我々の結果は、引き綱シルクのプロテオミクスおよび代謝成分を定義するだけでなく、それらの起源が 3 つに分かれた Ma 腺に由来することも追跡します。 尾、嚢、管の細胞タイプの数は、それらの機能の多様性と正の相関があります。

オレンジ色の黒丸は FPKM > 10,000 の遺伝子を表し、オレンジ色の白丸は FPKM < 10,000、CA クロマチン アクセシビリティ、Me メチル化の遺伝子を表します。 画像の作成にはAdobe Illustrator 2020を使用しました。

私たちの結果は、スピドロインの階層的に順序付けられた生合成に関するゲノムの手がかりを提供します。 我々は、MaSp1a–c および MaSp2e、MaSp2a–d、および MiSp-a–e 遺伝子が 3 つの異なるグループに分布していることを文書化しました。 さらに、これらの各グループ内の MaSp が、3 つのセクションからなる Ma 腺において協調した SC および ST 発現プロファイルを示すことを実証しました。 また、エピジェネティックレベルでグループ特異的な共通TFモチーフを同定し、ceRNAレベルでグループ特異的なlncRNA-miRNA-mRNAネットワークを構築しました。 このような結果により、他のクモゲノムでは報告されていないスピドロイン遺伝子の新規な構造的、発現的、および調節的特徴が明らかになった。 スピドロインは、引き綱シルクの機械的特性に重要な影響を与えると考えられています 16,57,58。 スピドロイン遺伝子のグループ分布は、カタログ化されたスピドロインタンパク質を含む T. antipodiana35 および Latrodectus elegans59 の高品質クモゲノムですでに特定されているため、我々のデータは染色体全体上のスピドロイン遺伝子の配置に関する重要な情報のギャップを埋め、一般的な情報を提供します。絹の機械的分化とクモゲノム進化のさらなる研究への入り口となります。

上記のゲノム所見に加えて、我々の結果は、Ma 腺の 3 つに分かれた組織と機能分割に関する細胞の手がかりを提供します。 これまでの研究では、クモグモの Ma 腺にはスピドロインを分泌する細胞型が 2 つまたは 3 つあることが示されています 21,60 が、Ma 腺の細胞型の数については議論の対象となっています。 これらの細胞型に関する多様な発見は、それらが種によって異なる可能性があることを示唆していますが、おそらく細胞および形態学的研究のためのサンプル調製後の無傷の細胞の捕捉における技術的困難も反映していると考えられます20、21、61。 私たちの研究は、Ma 腺全体に 10 種類の細胞が存在することを示す十分に検証された scRNA-seq および ST データを提供し、この論争の多い質問の答えに貢献します。 腺の魅力的な単細胞空間構造は、細胞状態遷移中の Ma 腺細胞の分化軌跡をさらに示しており、嚢と管が細胞分化を介して尾に存在する初期の細胞型に由来することを示唆しています。

私たちのゲノム、プロテオミクス、メタボロミクス分析により、絹糸生産腺における絹の生成に関する詳細がさらに明らかになりました。 物理的および材料的研究により、液体のシルクドープは、絹糸腺を通って移動する際に、pH とイオン勾配、および伸張力とせん断力の複合効果によって不溶性繊維に変化することが示されています 3,62。 私たちの研究は、絹糸腺のこの役割の生物学的証拠を提供し、さらに、カルシウムイオン結合、キチン結合、シグナル伝達、V 型 H+ 輸送など、クモの Ma 腺管とカイコ ASG におけるいくつかの分子機能が高度に集中していることを実証しています。 ATPアーゼの発現。 このような重複は絹糸腺特異的であり、他の組織タイプ（血球および卵巣）では確認されませんでした（補足図30）。 さらに、我々は、2 つのタンパク質 (ムチン-19 および GDH) および 2 つの主要な代謝産物 (コリンおよび DL-リンゴ酸) を含む、クモおよびカイコのシルクの収束シルク成分を同定しました。 これらの類似した側面は、シルクの形成に不可欠な重要なプロセスとコンポーネントを示しており、これらはシルク紡績の進化の理解に貢献し、ダクトベースの人工紡績装置の最適化と人工紡績におけるシルクタンパク質溶液の設計の参考として使用できます。

結論として、私たちの現在の研究は、オーブウィービンググモにおける引き綱シルク形成の生物学的基礎を包括的に説明しています。 私たちの知る限り、この研究はクモの糸紡ぎの生物学的メカニズムをこれほど詳細に明らかにした初めての研究です。 私たちは、ここで提示されたゴールデンオーブウェブスパイダーの染色体スケールの参照ゲノムと三分割されたマ腺の分子アトラスが、クモの糸紡ぎプロセスの理解を促進し、さらに、絹を紡ぐ生物の進化的研究。 さらに重要なことは、我々の結果と生成されたデータセットによって明らかになった重要な分子特性は、最終的に、遺伝子操作および生体模倣操作を通じて最適化された合成シルクを生産する道を開くはずであるということです。

T. clavata クモは、中国雲南省大理市で野生から捕獲されました。 捕獲された雌成体 T. clavata クモは 25 °C の室内で培養され、DNA 核型分析のために産卵後 3 日目に卵がサンプリングされました。 卵約20個をピンセットで潰し、0.05％コルヒチン1.5mLと3時間混合し、0.075mol/L KCl溶液で固定化し（20分）、メタノール：酢酸（3：1）溶液で固定（30分） 。 細胞懸濁液を予冷したガラススライド上に滴下し、火炎乾燥させ、５％ギムザ溶液で染色し（５０分間）、流水ですすぎ、風乾した。 染色体核型は、倍率 40 倍のオリンパス顕微鏡を使用して観察しました。

T. clavata の遺伝子セットをより包括的に捕捉するために、次の 18 の新鮮な組織 (補足データ 1) を PBS 溶液中で解剖しました: 女性の体 (TcF)、男性の体 (TcM)、血リンパ (Hem)、足触覚 (Ped)、脚（Leg）、表皮（Epi）、脂肪体（Fat）、卵巣（Ova）、毒腺（Ven）、大膨大部腺全体（Ma）、Ma腺尾部（Tail）、Ma腺嚢（ Sac）、Ma 腺管（Duct）、小膨大部腺（Mi）、管状腺（Tu）、鞭毛腺（Fl）、集合腺（Ag）、腺房状腺および梨状腺（Ac および Py）。 そして、各サンプルについて 3 つの独立した生物学的複製が実行されました。 次に、TRIzol 試薬を使用して全 RNA を抽出し、DNBSEQ プラットフォームで配列決定しました。

スピドロイン遺伝子アノテーションの品質を向上させるために、全長トランスクリプトーム シーケンスも実行しました。 7 つの絹糸腺組織 (Ma、Mi、Tu、Fl、Ag、Ac、および Py 腺) を混合して、PacBio プラットフォーム上でアイソフォーム シーケンス (Iso-seq) 用のライブラリーを構築しました。 フラグメントの偏りを減らすために、2 つのライブラリを構築しました。1 つは 0 ～ 10 kb の範囲で、もう 1 つは 5 ～ 10 kb の範囲です。

T. clavata ゲノムの de novo アセンブリの場合 (補足図 1c)、Nanopore ロングリードは、デフォルトのパラメーターを持つ Canu v2.263 を使用して最初に修正され、SMARTdenovo (https://github.com/ruanjue/smartdenovo)その後、一次コンティグの作成に使用されます。 次に、Racon v1.5.064 を使用して 3 回のコンティグ修正を実行しました。 アセンブリの精度を向上させるために、Illumina のショート リードに基づくコンティグ研磨に Pilon v1.2465 が利用されました。 ペアの Hi-C ショート リードは主に Hic-pro v2.1066 を使用してトリミングされ、最適化されたリードは、偽染色体構築には 3D-DNA v18041968 を、偽染色体構築には Juicebox v1.967 ツールを使用して、Juicer v1.6.267 でドラフト コンティグにマッピングされました。手動修正。

カスタム T. clavata リピート データベースは、RepeatModeler v269 および LTR_FINDER v1.0670 を使用して新規に識別されました。 次に、得られたリピート配列をRepeatMasker v4.0571にインポートし、ゲノム内の転移因子(TE)を検索しました。 Tandem Replys Finder v4.0972 を使用してタンデム リピートを検索しました。

遺伝子構造の予測は、相同性データと de novo 予測に基づいていました。 データ ファイルには、RNA 配列データ (17 組織の RNA 配列)、Iso 配列データ、および密接に関連した種 (4 種: A. ventricosus、A. bruennichi、T. antipodiana、および T. clavipes) のタンパク質配列が含まれていました。 。 AUGUSTUS v3.2.373 (http://bioinf.uni-greifswald.de/) ソフトウェアを de novo 遺伝子予測に使用しました。 証拠に基づいた遺伝子アノテーションは、デフォルトのパラメーターを使用して MAKER234 パイプラインで生成されました。 次に、以下のスクリーニング基準に基づいて MAKER 結果と de novo 結果を統合しました: 少なくとも 10 個のサンプルで、リピート配列の割合が 50% 未満、タンパク質配列の長さが 50 aa を超え、FPKM 値が 0.1 を超えていました。 、そしてその配列は、Iso-seq 証拠 (同一性 > 95%) または少なくとも 1 つの密接に関連した種からの対応する配列 (E 値 > 1e-5、同一性 > 50%) によって裏付けられました。

合計 443 個の冗長スピドロイン配列 (補足データ 6) を NCBI タンパク質データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein) からダウンロードしました。 T. clavata のすべてのタンパク質配列を使用して、blastp (E 値 < 1e-10) によってこれらのスピドロインを整列させたところ、128 個の非反復ヒットが主に同定されました。 スピドロインをさらに確実に同定するために、各配列に典型的なリピートと N 末端または C 末端が含まれていることを再確認し、最終的に 28 個の推定スピドロインを同定しました。

簡単に説明すると、(1) 79 個の完全なスピドロイン配列、48 個の N 末端配列、および 22 個の C 末端配列 (補足データ 7) を T. clavata ゲノムにマッピングし、genBlast v13874 ツールを使用して GFF トラック ファイルを生成しました。 (2) 絹糸腺 Iso-seq データと絹糸腺 RNA-seq データの両方の BAM ファイルが発現データ トラックとして抽出されました。 (3) 28 個のスピドロインの GFF3 ファイルが 1 つのトラックとして抽出されました。 (4) 前の 3 つのステップのトラック ファイルが IGV v2.9.475 にインポートされ、各スピドロインの整合性が手動でチェックされました。 (5) 対応するゲノム領域上の不完全なスピドロインの DNA 配列が切り詰められ、オンライン ツール AUGUSTUS v3.2.373 (http://Augustus.gobics.de/) を使用したフレームシフト翻訳と予測に基づいて修復されました。

アミノ酸含有量とモチーフは、Perl スクリプトを使用して定量化されました。 モチーフには、(GA)n、(A)n、GGX、XQQ、および GPGXX が含まれていました。 O-グリコシル化は NetOGlyc v4.076 ツールを使用して予測されました。

クモ T. clavata の引き綱シルクとカイコ B. mori の繭シルクをハサミで切りました (補足データ 1)。 まず、絹サンプル (n = 3、各サンプル 20 mg) を 500 μL の 9 M LiSCN に溶解し、遠心分離 (10,000 × g、10 分間) 後に上清を収集しました。 タンパク質濃度は、Bradford タンパク質アッセイ (Beyotime、中国) によって測定されました。 次に、サンプルを 8 M 尿素溶液で 10 倍に希釈し、5 × SDS-PAGE バッファーと混合し、NuPAGE 4-12% Bis-Tris タンパク質ゲル (Thermo Fisher Scientific、米国) を使用して分離しました。 続いて、サンプルをトリプシン (1/50 μg タンパク質) で 20 時間、37 °C で消化しました。 消化されたサンプルを凍結乾燥し、0.1% ギ酸 (FA) に再懸濁し、Q Exactive HF-X カラム (Thermo Fisher Scientific、米国) で LC-MS/MS によって測定しました。 勾配は、0.1% ギ酸中の 5 ～ 95% アセトニトリルに設定されました。 流量と分析時間は、それぞれ 600 nL/min と 70 分でした。 機器のパラメーターは次のとおりです。フル MS スキャンの範囲は m/z 350 ～ 1500、分解能は 60,000 (m/z 200)。 自動利得制御 (AGC) の目標値は 3 × 106、最大イオン注入時間は 20 ms でした。 フルスキャンで最も存在量の多い上位 40 個の前駆体が選択され、高エネルギー衝突解離 (HCD) によって断片化され、MS/MS で分析されました。分解能は 15,000 (m/z 200)、AGC 目標値は 1 でした。 × 105、最大イオン注入時間は 45 ms、正規化衝突エネルギーは 27% に設定、強度閾値は 2.2 × 104、動的排除パラメーターは 20 秒でした。 得られた生の MS データを MaxQuant v1.3.0.577 で分析しました。 MaxQuant 検索は、37,607 個のタンパク質配列を含む SpiderDB (https://spider.bioinfotoolkits.net) データベースに対して実行されました。 検索パラメータは、可変修飾としてメチオニン酸化およびN末端アセチル化を設定し、固定修飾としてカルバミドメチルシステインを設定した。 最小ペプチド長は 7 アミノ酸に設定され、最大 2 つの誤切断が許容されました。 ペプチドとタンパク質の同定は両方とも 1% の誤検出率でフィルタリングされました。 同定されたタンパク質には少なくとも 1 つの固有のペプチドが必要であり、一般的なリバースヒットと夾雑物はすべて除去されました。 ピーク強度の合計に基づいて、MaxQuant の強度ベースの絶対定量 (iBAQ) アルゴリズムを使用してタンパク質存在量を計算しました。

細断された引き綱シルクおよび繭シルクのサンプル (n = 6、各サンプル 20 mg) を代謝産物の抽出に使用しました (補足データ 1)。 各シルクサンプルをチューブに入れ、500 μL の 80% メタノール中でホモジナイズし、氷上で 10 分間保持し、15,000 × g で 20 分間、4 °C で遠心分離しました。 LC-MS/MS 実験のために上清 (サンプルあたり 250 μL) を収集し、流速 0.2 mL/min で 17 分間の直線勾配を使用して Hypesil Goldcolumn (C18、100 × 2.1 mm、1.9 μm) に注入しました。 正極性モードの溶離液は、溶離液 A (水中 0.1% FA) および溶離液 B (メタノール) でした。 負極性モードの溶離液は、溶離液 A (5 mM 酢酸アンモニウム、pH 9.0) および溶離液 B (メタノール) でした。 溶媒勾配は次のように設定されました: 2% B、1.5 分。 2 ～ 100% B、3 分。 100% B、10 分。 100–2% B、10.1 分。 2%B、12分。 Q Exactive HF 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific、米国) を、スプレー電圧 3.5 kV、キャピラリー温度 320 °C、シース ガス流量 35 psi、補助ガス流量 10 の正/負極性モードで操作しました。 L/min、S レンズ RF レベル 60、補助ガス ヒーター温度 350 °C。 フルスキャンの範囲は m/z 350 ～ 1500、解像度は 60,000 (m/z 200) でした。 AGC 目標値は 3 × 106、最大イオン注入時間は 20 ms でした。 フルスキャンで最も豊富な上位 40 個の前駆体が選択され、HCD によって断片化され、MS/MS で分析されました。解像度は 10 プレックスで 45,000 (m/z 200)、AGC ターゲット値は 5 × 104、最大イオン注入時間は 86 ミリ秒、正規化された衝突エネルギーは 32% に設定され、強度閾値は 1.2 × 105、動的排除パラメーターは 20 秒でした。 代謝物の正体と量は、mzCloud (https://www.mzcloud.org/)、mzVault (mzCloud Offline for mzVault 2.3_2020A.db)、および質量リストとのアライメントを含む、Compound Discoverer 3.1 (CD 3.1) ソフトウェア分析によって確認されました。 (Endogenous Metabolite-Animal-POS/NEG-20191029) データベース (取得日: 2020 年 6 月 15 日)。 さらに、KEGG78（https://www.kegg.jp/）、HMDB79（https://hmdb.ca/metabolites）、LIPIDMaps80（http://www.lipidmaps.org/）のデータベース（検索日：7） /17/2020) を代謝物のアノテーションに利用しました。

分離したMa腺の尾部、嚢、管をWGBSに供した。 まず、ゲノム DNA を抽出し、Bioruptor (Diagenode、ベルギー) を使用した超音波処理によって平均サイズ 250 bp に断片化し、続いて DNA 断片の 3' 末端に「A」塩基を付加し、 DNA 断片の両端にメチル化されたアダプター。 EZ DNA メチル化ゴールド キット (ZYMO) を、ライゲーションされた DNA の重亜硫酸塩変換に使用しました。 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA) を使用して生成物を精製し、PCR によって増幅しました。 最後に、Illumina HiSeq 2500 プラットフォームでライブラリーの配列を決定しました。

BSMAP 2.90 ソフトウェア (https://code.google.com/archive/p/bsmap/) をパラメーター (-v 8 -z 33 -p 4 -n 0 -w 20) で使用して、クリーンリードを参照ゲノムにマッピングしました。 -s 16 -f 10 -L 100) アダプターを取り外した後、低品質の読み取り (N > 10% および Q < 20)。 メチル化レベルは、対応するベータ値を決定することによって推定されました: ベータ = M/(M + U)。ここで、M および U はそれぞれメチル化および非メチル化シグナル値を表します。 メチル化データの BED ファイルは、「bedGraphToBigWig」コマンド ラインを使用して BigWig 形式に変換され、IGV75 で視覚化されました。

分離されたMa腺の尾部、嚢、および管をATACシーケンスに供した。 サンプルを液体窒素中で個別に粉砕し、4 °C で 10 分間予冷した細胞溶解液に移しました。 遠心分離 (500 × g、4 °C、10 分) 後、上清を除去し、細胞ペレットを保持しました。 ペレットをあらかじめ冷却した緩衝液で洗浄し、遠心分離（500×g、4℃、10分間）して細胞核を回収しました。 細胞核溶液を Tn5-トランスポザーゼと混合し、37 °C で 30 分間インキュベートした後、Illumina PE150 プラットフォームで DNA 断片の収集、PCR 増幅、配列決定を行いました。

Bowtie281 ソフトウェアを使用してクリーン リードをゲノムにマッピングし、データを .sam 形式から .bam 形式に変換し、パラメータ (view -b -f 2 -q 30) を指定した SAMtools v0.1.1982 を使用してリードをフィルタリングしました。 クロマチンアクセス領域のピークは、MACS283 (-shift -100-extsize 200-nomodel -B -q 0.05) を使用して各サンプルで個別に同定されました。 BEDTools v2.26.084 の「intersect」コマンドを使用して、複製サンプル間の共有ピークを特定しました。 ヒートマップは、deepTools v3.5.185 の「plotHeatmap」機能を使用して生成されました。 大幅に濃縮されたモチーフが HOMER86 ツールによって同定されました。

以下に説明するように、TRIzol 試薬を使用して Ma 腺の尾、嚢、および管から全 RNA を抽出し、続いて lncRNA および miRNA ライブラリーを構築しました。

トータル RNA サンプルを DNase I とインキュベートして DNA 断片を消化し、RNase H とインキュベートして rRNA を除去しました。 RNA精製後、3'末端に「A」塩基を付加したcDNAを合成し、アダプターライゲーションを行った後、第2鎖のUDG消化とPCR増幅を行った。 構築されたライブラリーは、DNBSEQ プラットフォーム上で配列決定されました。 クリーンリードは、HISAT287 (-phred64-sensitive-no-discordant-no-mixed -I 1 -X 1000) を使用して参照ゲノムにマッピングされ、転写産物は StringTie88 (-f 0.3 -j 3 -c 5 -) を使用してアセンブルされました。 g 100 -s 10000 -p 8)、Cufflinks89 の CuffCompare (-p 12) プログラムを使用して既知の mRNA と比較しました。 次に、協調データ分類 (CPC)、txCdsPredict、およびコーディング ノンコーディング インデックス (CNCI) メソッドを使用して、mRNA と lncRNA を区別しました。 シスおよびトランス法を使用して、lncRNA の標的 mRNA を評価しました。 Cis-lncRNA は、標的 mRNA の 10 kb 上流または 20 kb 下流に位置する lncRNA として定義されました。 lncRNA と mRNA の結合エネルギー (BE) を RNAplex90 で分析し、BE が -30 未満の場合、lncRNA はトランス lncRNA であるとみなされました。

全ＲＮＡを精製し、ＰＡＧＥ電気泳動を使用して単離し、次いでゲルから切り出し、１８〜３０ｎｔのＲＮＡ断片を得た。 各低分子 RNA フラグメントの 3' 末端を 5-アデニル化および 3-ブロック化アダプターにライゲーションし、ユニーク分子識別子 (UMI) 標識プライマーを 3' アダプターとのハイブリダイゼーションのために追加しました。 次に、5'アダプターをUMIラベルの5'末端とハイブリダイズさせた。 cDNA鎖はUMI標識プライマーを使用して合成され、高感度ポリメラーゼを使用して生成物が増幅されました。 Bowtie281 (-q -L 16–phred64 -p 6) を使用して、クリーンリードを参照ゲノムおよび Rfam small-RNA データベース 91 に位置合わせしました (パラメーター –cpu 6 –noali を指定した cmsearch を使用)。 miRBase92 データベース (https://www.mirbase.org/) と miRDeep293 ツールでアノテーションが付けられ予測された miRNA を特定するために、miRanda43 (-en -20 -strict) と RNAhybrid44 を使用して miRNA と lncRNA/mRNA の間でターゲットを予測しました。 (-b 100 -c -f 2,8 -m 100000 -v 3 -u 3 -e −20 -p 1)。

3 匹の独立したクモから新たに解剖した Ma 腺を培地を使用して洗浄し、小片に切断し、組織片を定温インキュベーター内で 45 分間消化しました。 消化後、培地を 40 μm のセルシーブで濾過し、300 × g、4 °C で 5 分間の遠心分離により少なくとも 3 回洗浄しました。 最後に、活性が 85% を超え、凝集率が 5% 未満の細胞懸濁液をライブラリーの構築と配列決定に使用しました。 ライブラリーは、10 × Chromium Single Cell 3' プラットフォーム上でメーカーの指示 (10 × Genomics) に従って構築されました。

生データを cellranger v4.0.0 パイプラインにインポートして、各細胞と各遺伝子の発現マトリックスを取得しました。 低品質の細胞を除去するために、中央値±絶対偏差中央値 (MAD) の 2 倍の範囲内の細胞数と遺伝子 UMI 数をさらなる分析のために保持しました。 さらに、DoubletFinder v2.0.394 を使用してダブレット (1 つの油滴に 2 個以上のセル) を削除しました。 合計 9,349 個の高品質セルを使用して、Seurat v4.0.695 パッケージに基づいてクラスター化と発現を分析しました。 すべての細胞クラスターの発生軌跡は、Monocle v2.22.096 パッケージを使用して予測されました。

新鮮な Ma 腺を液体窒素中のイソペンタンで凍結し、OCT で包埋し、気密容器に入れて -80 °C で保存しました。 包埋された凍結組織を切片化し、許容可能なRNA品質(RIN > 7.0)を有する切片をさらなる実験に使用した。 次に、切片を Visium Spatial スライド上に置き、メタノールで固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、BX53 顕微鏡 (オリンパス、日本) で観察しました。 ポリアデニル化された mRNA は、スポットに使用されたプライマーで捕捉されました。 続いて、RT Master Mix 逆転写試薬を浸透組織切片に添加し、Second Strand Mix を添加することによってスライド上で第 2 鎖 cDNA 合成を実行しました。 得られた cDNA は各捕捉ゾーンから変性され、増幅、ライブラリー構築、および Illumina NovaSeq600 プラットフォームでの配列決定のために対応するチューブに移されました。

アダプターと低品質 (N > 3、Q < 5、塩基率 ≥ 20%) 読み取りを削除した後、spaceranger v1.3.1 mkref および count プログラムをデータの前処理に使用しました。 次に、Seurat v4.0.695 パッケージを使用してスポット クラスタリングを分析しました。

カイコの絹糸腺とクモの Ma 腺の間の収斂進化の発生を評価するために、5 つの側面を比較しました (詳細については補足を参照)。(1) 絹糸腺の形態学的構造。 (2) 加速電圧 5 kV の SU3500 走査型電子顕微鏡 (SEM) (日立、日本) で観察された引き綱シルクと繭シルクの微細構造。 (3) 絹糸腺遺伝子の発現の収束、(4) 引き綱シルクと繭シルクの相同タンパク質成分。 (5) 引き綱シルクおよび繭シルクの代謝物成分。 カイコとクモが共有するオルソロガス遺伝子は、blastp97 プログラムを使用して同定されました (E 値 < 1e−5)。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

このプロジェクトのハイスループット シーケンシングの生データはすべて、国立ゲノミクス データ センター (NGDC、https://ngdc.cncb.ac.cn/) のゲノム配列アーカイブ (GSA) に寄託されており、BioProject ID PRJCA014503 を通じて利用できます。 質量分析プロテオミクス データは、データセット識別子 PXD038734 とともに iProX パートナー リポジトリ 98 経由で ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset) に寄託されています。 メタボロミクス データは NGDC (https://ngdc.cncb.ac.cn/omix/release/OMIX002862、https://ngdc.cncb.ac.cn/omix/release/OMIX002863) に寄託されています。 単一セルおよび空間メトリクスは、FigShare (https://figshare.com/articles/dataset/Single_cell_matrices_zip/20399475、https://figshare.com/articles/datasset/Spatial_Transcriptomics_zip/20399580) に保管されています。 Trichonephila clavata のゲノムアセンブリ、遺伝子アノテーション、マルチオミクス解析結果は SpiderDB (https://spider.bioinfotoolkits.net) からも入手できます。 ソースデータは図に提供されています。 1、2、4、5。ソース データはこのペーパーに付属しています。

データ分析用のカスタム スクリプトとワークフローは、FigShare (https://figshare.com/articles/dataset/SpiderGenomeAnanosis_code_zip/20399652、https://figshare.com/articles/dataset/SpiderGenomeAnanosis_code1_zip/20399706) で入手できます。

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原稿を批判的に読んでくださった南西大学の Daojun Cheng 氏と南西大学の Yi Zou 氏に感謝します。 核型分析に協力してくれた四川農業大学のYazhou Liに感謝します。 また、マルチオミクス シーケンスを提供してくださった BGI、Novogene、Frasergen、OE Biotech、Berry Genomics 企業にも感謝します。 この研究は、中国国家自然科学財団 [U21A20248]、中国国家自然科学財団 [32000340]、および中央大学の基礎研究基金 [XDJK2019TJ003] によって支援されました。

Wenbo Hu、Anqiang Jia などの著者も同様に貢献しました。

カイコゲノム生物学の国家重点実験室、生物科学研究センター、西南大学、重慶、400715、中国

Wenbo Hu、Anqiang Jia、Sanyuan Ma、Guoqing Zhang、Zhaoyuan Wei、Fang Lu、Yongjiang Luo、Jiahe Sun、Tianfang Yang、TingTing Xia、Qinhui Li、Ting Yao、Jiangyu Zheng、Zijie Jiang、Zehui Xu、Qingyou Xia、Yi Wang

西南大学生命科学部、重慶、400715、中国

張志生

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WH、AJ、QX、YW がプロジェクトの概念を策定しました。 YWがプロジェクトを監督しました。 WH、AJ、ZZ、JS、TY、TX、QL、TY、JZ、および YW は、マルチオミクス シーケンス用のサンプルを収集しました。 AJ はゲノム アセンブリ パイプラインを設計および実装し、データ分析を実行しました。 WH と AJ が原稿を書きました。 FL、YL、ZJ、ZX がデータを生成し、データベースを構築しました。 WHとSMが実験を実施した。 YW は、すべての著者からの意見をもとに原稿を完成させました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Xia Qingyou または Yi Wang への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Nadia Ayoub 氏、Shuqiang Li 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Hu、W.、Jia、A.、Ma、S. 他分子アトラスは、クモの引き綱糸の 3 つの部分からなる紡糸機構を明らかにします。 Nat Commun 14、837 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36545-6

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受信日: 2022 年 7 月 19 日

受理日: 2023 年 2 月 7 日

公開日: 2023 年 2 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36545-6

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