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Apr 29, 2023

実験計画画面により、Clostridium novyi が明らかになりました。

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 118 (2023) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

Clostridium novyi-NT は、低酸素腫瘍内で発芽してがん細胞を殺す抗がん細菌治療薬ですが、C. novyi-NT の実際の発芽トリガーはまだ不明です。 この研究では、組み合わせ実験計画を使用して候補発芽菌をスクリーニングし、D-バリンが強力な発芽剤であり、4.2 mM 濃度で 50% の胞子発芽を誘導することを偶然により発見しました。 さらなる調査により、5 つの D-バリン類似体も発芽体であり、これらの類似体のうち 4 つは鏡像異性体ペアであることが明らかになりました。 L-アミノ酸とD-アミノ酸のこの立体柔軟効果は、胞子の発芽が複雑なプロセスであり、鏡像異性体相互作用が交絡因子となる可能性があることを示しています。 この研究では、L-システインが発芽物質として、ヒポキサンチンとイノシンが共発芽物質として特定されました。 他のいくつかのアミノ酸は、相互作用依存的に発芽を促進 (L-バリン、L-ヒスチジン、L-スレオニン、L-アラニン) または阻害 (L-アルギニン、L-グリシン、L-リジン、L-トリプトファン) します。 D-アラニンは、複雑な増殖培地であっても、すべての発芽を阻害します。 この研究は、腫瘍における C. novyi-NT 胞子の発芽効率を改善するための基礎を築きます。

Clostridium novyi A 型は、ヒツジ、ヤギ、ブタにクロストリジウム筋壊死、巨頭、壊死性肝炎を引き起こす偏性嫌気性芽胞形成細菌です1。 特に、これは雄羊の「ディッコップ」頭腫脹の原因となっており、この感染症は、若い雄羊同士が争う際に負った傷を介して起こり、48～72時間以内に死亡する。 C. novyi は、C. novyi 胞子によってヘロインが汚染されていたスコットランドの麻薬使用者の間で散発的に感染症が発生したことを除いて、ヒトよりも牛の病原体です。

C. novyi-NT は、アルファ毒素の弱毒化によって生成された野生型細菌の非致死性バージョンであり、固形腫瘍の実験的治療法として現在臨床試験中です 4,5。 C. novyi-NT の治療可能性は、腫瘍の低酸素領域 (酸素 0.5% 未満) に選択的にコロニーを形成し、局所的な細胞傷害効果を発揮する能力に由来します 6。 C. novyi-NT よりも前の他のクロストリジウム菌の殺腫瘍効果が研究されてきましたが、C. novyi-NT は栄養杆体ではなく胞子として投与された最初の菌でした 4。 C. novyi-NT を胞子として投与すると、比較的非免疫原性であることに加えて、低酸素腫瘍微小環境内で発芽が促進されるため、腫瘍特異性がさらに高まります 4,6。 胞子は休眠状態にあるため、栄養状態では死んでしまう酸素に対しても耐性があります6。 したがって、胞子は腫瘍治療にとって理想的なクロストリジウム菌の形態であるが、C. novyi-NT 胞子が発芽する仕組みについては、還元環境の要件以外にはほとんど知られていない。 さらに、C. novyi-NT が一部の腫瘍に対して有効なコロニー形成者であるのに、他の腫瘍に対してはそうでない理由は依然として謎のままです7。

細菌の胞子と発芽に関する現在の知識は、主にバチルス属とクロストリジウム属に基づいています8,9。 本質的に、細菌は代謝資源が不足しているときに胞子形成しますが、資源が豊富な条件が再び普及すると発芽します。 休眠状態で有利な条件が戻るのを辛抱強く待つ能力には、胞子形成細菌の生存上の利点が凝縮されています。 病原性細菌では、良性胞子が標的環境に感染すると、毒素を産生する栄養型に発芽するため、この周期的なプロセスが発病を促進します10、11、12。 発芽は 2 つの段階に分けることができます13。 第 1 段階は、小分子栄養発芽体と発芽受容体 (GR) と呼ばれる特定のタンパク質との相互作用から始まります。 GR の活性化により、一価陽イオン (H+、K+、Na+) とジピコリン酸カルシウム (CaDPA) の放出が引き起こされるほか、胞子核の部分的な水和も引き起こされます。 第 2 段階では、胞子皮質層が加水分解され、核の拡張と完全な水和が起こり、休眠からの移行が完了します。 その後、DNA、タンパク質合成、および主要な代謝経路が活性化し、その結果栄養型が増殖します14。

細菌の胞子は、アミノ酸 15、プリン 16、糖 17、胆汁酸塩 18、イオン 19 などの幅広い要因に応答して発芽することが知られています。 発芽菌は栄養環境の重要な相関関係にあり、胞子形成細菌は発芽菌を胞子休眠から抜け出すための信号として利用するように進化してきました。 発芽体のスクリーニングは、通常、単一の候補発芽体の存在下で、光学密度または屈折率の低下によって通知される胞子発芽を検出することによって行われます。 しかし、実際の発芽環境は複雑で、推定上の発芽物質の効果を増強したり拮抗したりする可能性のある複数の要因が含まれています。 たとえば、クロストリディオイデス ディフィシレの胞子は、タウロコール酸胆汁酸塩の存在下で発芽します。 しかし、腸内環境では、この発芽は、リトコール酸塩やウルソデオキシコール酸塩などの他の微生物由来の二次胆汁酸塩によって拮抗される可能性があります20。 逆のシナリオでは、環境内の他の要因との正の相互作用を必要とする推定上の発芽菌が、単一の候補として評価された場合、偽陰性の結果が得られる可能性があります。

候補発芽菌を 1 つずつ個別にスクリーニングしても、それらの間に相互作用が存在する場合、常に不完全な全体像が得られます。 したがって、発芽因子を組み合わせてスクリーニングするアプローチが必要です。これは、変数の数が増加するにつれて、一度に 1 つの因子のみを変更するという従来の直感が指数関数的に非効率になるためです。 実験計画法 (DOE) アプローチでは、複数の要因が構造化された方法で同時に変更されます21。 胞子生物学の分野では、DOE は細菌の胞子形成 22、23、24 および培養 25、26、27 の培地成分を最適化するために使用されています。 この研究では、DOE を使用して、最も重大な影響を持つ発芽因子とそれらの間の相互作用を特定します。 これらの実験により、発芽候補および共発芽候補が明らかになり、さらに、C. novyi-NT の強力な発芽物質として D-バリンとその類似体が偶然に観察されることにもつながりました。

補足表 1 は DOE 設計の例であり、行は独立した実験を表し、列はテストされた要素を表します。 各行は、存在する (+) か存在しない (-) かのテスト対象因子の異なる組み合わせをテストします。 各列には同数の + および - レベルがあり、隣接して配置されたランダムに選択された 2 つの列には、同数のペアのレベル (++、+-、-+、および --) があります。 したがって、各因子の各レベル (+ または -) は、他のすべての因子の各レベル (+ または -) と同じ回数だけ関連付けられます。 したがって、任意の因子の + レベルと - レベルは、両方とも他の因子からのまったく同じバランスのとれたバックグラウンドの影響を受けるため、相互に直接比較できます。 このように使用される DOE スクリーニングは、効率的な実験回数を使用して、多数の候補因子の中から最も重要な因子を推定します。

我々は、一次発芽株、共発芽株のスクリーニング、および同定された候補間の相互作用の3つの方法でC. novyi-NTの発芽要件を特徴付けました（図1a）。 プラケット・バーマン (PB) 計画 (補足表 1) は、テストする因子の数が多い (>5) 場合の最初の実験で使用されました。 この数が主要な発芽促進菌にフィルタリングされると、完全な要因計画 (補足表 2) を使用してそれらの間の相互作用が分析されました。 すべての実験において、発芽は経時的な OD600 の低下によって測定されました。 すべての発芽陽性の読み取り値は、位相差顕微鏡下での屈折率の損失によって検証されました。 偽陰性を最小限に抑えるために、発芽菌スクリーニングでは高い非生理学的濃度が最初に使用されました。 その後、用量反応研究を使用して、生理学的濃度でスクリーニングされた発芽株を研究しました。 この研究では、すべての発芽候補が補足表 3 にリストされ、DOE グラフで使用される専門用語が補足表 4 に定義され、実行されたすべての統計検定が補足表 5 にリストされています。

実験計画法 (DOE) アプローチの概略図。 b 補足表 3 の濃度の 20 個の L-アミノ酸を、補足表 1 の Plackett-Burman (PB) 設計に従って、さまざまな組み合わせで追加しました。図は、発芽応答の降順 (上から下) でソートされたさまざまな組み合わせを示しています。図は、左から右へ昇順に並べた、ΔODに対する各L-アミノ酸の影響（下の行）も示しています。 マトリックスの 2 つの端で赤と緑で強調表示されている因子は、それぞれ最も重要な拮抗作用と発芽促進作用を持つ L アミノ酸を表します (ɑ = 0.0005)。 すべてのデータは、それぞれ 2 回反復した 2 回の独立した実験から平均化され、平均応答値を表します。 c 補足表 3 の濃度の 2 倍の 20 個の L-アミノ酸をウェルごとに個別に添加しました。 単一因子としての 20 個の L-アミノ酸の発芽範囲散布図を示します (平均 ± SD)。n = 4 の生物学的に独立したサンプル。 破線は発芽の 10% 閾値を表します。 L-アミノ酸は、発芽率 (補足表 4 で定義) に従って、左から右の順に最高から最低に分類されます。 紫色の影付き領域は、L-バリンと比較して顕著な発芽を示す L-アミノ酸を強調表示します (対応のない t 検定、****p < 0.0001)。 d PBスクリーニング（緑）および単一因子スクリーニング（紫）を通じて発見された重要な発芽促進候補のベン図。

L-アミノ酸は栄養素の存在を知らせ、細菌の胞子の最も一般的な発芽物質です。 我々は、20 の標準的な L-アミノ酸 (補足表 3) を取得し、2 つの並行したアプローチを使用して発芽特性についてテストしました。 最初に、Plackett-Burman (PB) 設計と呼ばれる特定の DOE アプローチを使用して、L-アミノ酸の組み合わせをテストしました28。 2 番目では、通常行われているように、各 L-アミノ酸を個別にテストしました。

通常の発芽スクリーニングと並行して PB を実行する理由は何ですか? まず、PB スクリーニングでは、発芽菌だけでなく発芽拮抗物質も同定されます。 2 番目の理由は相互作用に関係しています。 PB は設計上、因子の組み合わせに基づいていますが、因子間に交互作用が存在する場合、単一因子スクリーニングとは異なる結果が得られます。 これは、独立因子のスクリーニングという主な目的に PB を使用する場合の制限です。 ここでは、この性質を意図的に利用して、L-アミノ酸間の相互作用の存在を明らかにします。 結局のところ、発芽L-アミノ酸が別のL-アミノ酸の存在下で多かれ少なかれ強力になるように相互作用が存在する可能性があると考えられます。 逆に、相互作用が存在しない場合は、両方の画面で同じ結果が得られるはずです。

PB スクリーニングでは、各アミノ酸が組み合わせの半分に存在し、残りの半分に存在しないように、20 の標準 L-アミノ酸の 24 の組み合わせが構築されました (補足表 1)。 PB デザインでは、L-アミノ酸の可能な 220 個の順列すべてのほんの一部をテストする必要があるため、1 つの組み合わせに対応する各ウェルを備えた 1 つのマイクロタイター プレートで、動態 OD600 測定を伴う 1 回の PB 実験を実行できます。 2 つの PB 実験 (それぞれの組み合わせごとに 2 つの反復) が実行され、標準化された効果の正規プロットが補足図 S1 に示されています。 さらに、各組み合わせのΔODと各L-アミノ酸に関連する効果のより直感的なデータ表現を図1bに示します。 列は、発芽に対する関連する影響によって順序付けされた候補発芽物質のランクを示し、一方、行は、発芽応答によって順序付けされたこれらの候補のランクの組み合わせを示します。 この研究では、「発芽促進因子」または「発芽促進因子」という用語を、単独で作用するか（例えば、一次発芽因子として）、または組み合わせて作用するか（例えば、発芽因子として）に関係なく、発芽を促進する因子を指すために使用します。共発芽剤）。 列に沿って、4 つの発芽促進因子 (L-バリン、L-システイン、L-ヒスチジン、L-スレオニン) と 4 つの発芽抑制因子 (L-アルギニン、L-グリシン、L-リジン、L-トリプトファン）は、有意な効果があることが確認されました（99.95 CI、モデル適合 R2 = 92.1%）。 行は組み合わせを表し、同様に発芽応答によって順位付けされているため、相互作用がなければ、単一の候補発芽株をすべて含む行が最上位またはその近くにランクされることが予想されます。 代わりに、すべての候補を含む行が 24 行中 11 行目にあることがわかります。この行を視覚的な参照として使用すると、発芽促進因子が行 11 より上の右上に豊富に表示されます。 逆に、発芽抑制因子は、行 11 の下、左下に豊富に含まれています。 これは、行 11 から発芽抑制因子を差し引くと発芽反応が増加するはずであり、これらの組み合わせは行 11 より上位にランクされるはずであるという直感と一致します。一方、行 11 から発芽促進因子を差し引くと、次のような逆の効果が生じます。これらの結果は、相互作用を考慮しないことで重要な情報を見逃していることを示しています。 PBスクリーニングと並行して、20個のL-アミノ酸のそれぞれを発芽候補として独立して評価する単一因子スクリーニングが実行されました（図1c）。 ここで、L-システインと L-アラニンは 10% 以上の発芽を有意に誘導し、発芽体として同定されました。

総合すると、PBと単一因子の両方の結果は、典型的な単一因子発芽スクリーニングでは反映されない方法で、相互作用が実際に発芽因子の活性を調節することを示しています（図1d）。 L-システインは両方のスクリーニングで同定された唯一の発芽物質であり、他のアミノ酸と混合した場合でもその発芽能力が有効であることが示されました。 残りの発芽菌は、PB または単一因子スクリーニングのみで同定されました。 例えば、L-アラニンは単一因子スクリーニングでのみ同定されており、単一因子としてのその発芽能力が他のアミノ酸との阻害性相互作用によって隠蔽されていることを示唆している。 最後に、PB スクリーニングのみで L-バリン、L-ヒスチジン、および L-スレオニンが発芽物質として同定されました。 これは、特定の L-アミノ酸は、それ自体では不活性ですが、環境中の他の要因の存在下では発芽を促進する可能性があることを示しています。

次に、これらの発芽菌の25の組み合わせすべてをそれらの間の相互作用についてテストすることにより、発芽にプラスの効果があると特定された5つのL-アミノ酸間の相互作用（図1d）を研究しました（図2aおよび補足表2）。 図1bと同様に、図2aの列は発芽に対する影響によってランク付けされた発芽促進剤を示し、行は発芽応答によってランク付けされたこれらの発芽促進剤の組み合わせを示します。 これらの結果では、L-システインが上位の行を占め、下位の行には存在しません。 つまり、L-システインが存在する場合にのみ、高い発芽反応が達成されます。 他のL-アミノ酸の発芽促進剤と比較したL-システインの発芽促進剤としての優位性は、図2bの別の視覚化にも反映されており、発芽反応をヒートマップではなく傾きとして示しています。 L-システインの優位性は、PB スクリーニングと単一因子スクリーニングの両方で同定された唯一のアミノ酸であることと一致しています。 これはおそらく、L-システインが他の L-アミノ酸によって容易に拮抗されない強力な一次発芽効果を持っていることを反映していると考えられます。 対照的に、L-バリンと L-アラニンは弱い次点でした (図 2a、b)。 さらに深く掘り下げて、5 つの L-アミノ酸の発芽促進剤間に有意な相互作用があるかどうかを調べました。 この分析の結果は、二次相互作用プロットとして示されており、アミノ酸ペアが存在する場合と存在しない場合の、考えられるすべてのアミノ酸ペアの発芽応答を示します (図 2c)。 各ボックスで囲まれたグラフは 2 つのアミノ酸ラベルの交点に位置し、1 つはボックスと同じ行 (「行因子」) に沿っており、もう 1 つはボックスと同じ列 (「列因子」) に沿っています。 各ボックス グラフ内で、青い線は列因子のベースライン発芽応答を確立し、赤い線は行因子が存在する場合の修正された発芽応答を示します。 相互作用がない場合、期待される結果は、各ボックス グラフの赤と青の線がほぼ平行になることです。 これは図 2c の観察であるため、5 個の L アミノ酸の発芽促進物質間に強い相互作用は存在しないという結論になります。

発芽促進因子（パネル a ～ c​​）および L-システイン発芽のアンタゴニスト（パネル d ～ f）を含む完全な要因実験を実行しました。 両方の実験計画の詳細を補足表 2 に示します。使用した濃度は Plackett-Burman スクリーニングと同じでした。 a、d 図は、補足表 4 に定義されているように、ΔOD (一番右の列) の降順 (上から下) に並べ替えられた因子のさまざまな組み合わせを示しています。 ΔOD に対する各 L-アミノ酸の効果 (下の行)、左から右へ昇順に並べたものも表示されます。 b、e 発芽促進L-アミノ酸（丸付き青線、モデルɑ = 0.0001）およびアンタゴニストL-アミノ酸とL-システイン（丸付き赤線、モデルɑ = 0.001）の主な相互作用プロット。それぞれ平均を示しています。各アミノ酸濃度に対するΔODの値。 c、f 因子のすべてのペア間の相互作用を示す二次交互作用プロット。 丸付きの青い線は示された L-アミノ酸の存在を表し、丸付きの赤い線は存在を表します。 すべてのデータは、それぞれ 2 回反復した 2 回の独立した実験から平均化され、平均応答値を表します。 正の傾きは発芽に対する正の効果を示し、負の傾きは阻害効果を示します。

PB スクリーニングでは発芽を無効にするアミノ酸も同定されていたため、同じセットの全因子分析を使用して、これら 4 つの負の因子 (グリシン、L-アルギニン、L-リジン、および L-トリプトファン) が L に及ぼす影響を研究しました。 -システインは発芽を誘導します。 全因子ヒートマップでは、L-システインは必要ですが、強力な発芽反応には不十分であることがわかります（図2d）。 L-システインは、唯一顕著な発芽が起こる上部 4 列に存在します。 L-アルギニンまたはL-グリシンが存在すると、L-システインの発芽効果はゼロになります。 図2eの別の視覚化は、この観察を裏付け、さらにL-リジンとの相互作用が弱いことを明らかにしています。 この直感は、複数のボックス グラフの非平行な青と赤の線を示す二次相互作用プロット (図 2f) によってさらに強化されます。 予想どおり、L-システイン + L-グリシンおよび L-システイン + L-アルギニンに関連する 4 つのボックス グラフで平行からの逸脱が観察されます。 さらに、L-アルギニンとL-グリシンに関連する2つのボックスグラフにも平行からのずれがあります。 これらの両方のグラフにおいて、L-アルギニンとL-グリシンの両方が存在しないことは、L-システインによって引き起こされる高い発芽と関連しています。 ただし、L-アルギニンまたはL-グリシン、あるいはその両方が存在すると発芽しません。 上記の完全な要因分析は、自然環境中の抑制性アミノ酸が L-システインの強力な発芽促進効果に対する拮抗修飾因子として作用する可能性があることを示唆しています。 興味深いことに、PB スクリーニングでは阻害効果があった L-トリプトファンは、発芽に対してわずかにプラスの効果を示しました。 したがって、発芽に対する特定のアミノ酸の影響は非常に状況に依存する可能性があり、候補発芽体の組み合わせ空間を精査する必要性が強調されます。

次に、細菌胞子の中で L-アミノ酸に次いで一般的な発芽物質であるプリン誘導体をテストしました。 プリン候補は、完全要因スクリーニングと単一要因スクリーニングを使用して並行してテストされましたが、どちらのスクリーニングでも発芽を引き起こすものは見つかりませんでした（補足図S2a〜S2c）。 プリンは共発芽物質として作用することが知られており 29、テストされたプリンの数が少なかったため、5 つのプリンのすべての可能な組み合わせを使用した完全要因スクリーニングを設計しました。 完全な発芽を引き起こすには不十分な次善の L-システイン濃度をベースライン条件として使用しました。 したがって、L-システインに対する共発芽活性は、OD600 の低下の増加によって明らかになります。 結果は、ヒポキサンチンとイノシンは両方ともL-システイン媒介発芽の強力な共発芽剤であるのに対し、アデノシン、キサンチン、およびキサントシンは発芽を阻害することを明白に示しています（図3a、b）。 二次相互作用プロット (図 3c) は、ヒポキサンチンとイノシンの間のプロットの非平行線をさらに明らかにします。 ここで、強力な発芽を引き起こす共発芽剤としては、ヒポキサンチンまたはイノシンのいずれか一方のみで十分であり、両方が存在することによって発芽の程度が向上するわけではない。 また、ヒポキサンチン対アデノシンおよびヒポキサンチン対キサントシンのあまり劇的ではない非平行グラフも注目に値します。 これらは、ヒポキサンチンの発芽促進効果がアデノシンとキサントシンによってわずかに拮抗されることを示しています。

発芽反応は、補足表 2 (パネル a ～ c​​) に詳述されている要因計画に従って、プリン (0.1 mM) のすべての組み合わせについて L-システイン (10 mM) の存在下で測定されました。 a図は、主要発芽L-システインの存在下でのプリンのさまざまな組み合わせを示し、補足表4に定義されているΔOD（一番右の列）の降順（上から下）で並べ替えられています。図は効果も示しています（下の行） ) ΔOD 上の各プリンを左から右へ昇順に並べたもの。 b 5 つのプリン類似体の主な相互作用プロット (丸付きの青い線、モデル ɑ = 0.0005)。 c 因子のすべてのペア間の相互作用を示す二次相互作用プロット。 丸付きの青い線は示されたプリンの存在を表し、丸付きの赤い線はプリンの存在を表します。 d 5 つのプリン類似体の構造。 C2-N3 二重結合 (緑色の矢印) を特徴とする還元されたプリン環は発芽に関連しています。 すべてのデータは、それぞれ 2 回反復した 2 回の独立した実験から平均化され、平均応答値を表します。

これらの共発芽効果が状況依存的であるかどうかを理解するために、これらの同じ5つのプリンを単独で、つまり組み合わせではなくテストしました（補足図S2c）。 ここで、ヒポキサンチンとイノシンが依然として強力な同時発芽効果を示していることがわかり、初期の完全要因実験が裏付けられました。 しかし、さらに、アデノシンは、完全な要因実験における阻害効果とは対照的に、顕著な共発芽効果も示しました。 アデノシンに対するこのような文脈上の影響は前例のないものではありません。 例えば、アデノシンは、イノシンによって引き起こされるセレウス菌胞子の発芽を阻害すると同時に、L-アラニン30との共発芽剤として作用します。 C. novyi-NT の場合、アデノシンは他のプリンが存在しない場合には強力な共発芽剤として機能すると思われますが、そうでない場合はおそらくそうではありません。

試験したプリンの構造と発芽活性を比較することにより、ヒポキサンチン、イノシン、およびアデノシンがプリン環の還元型を共通に共有しており、N3 と C2 の間の二重結合を特徴としており、これが共発芽活性に重要である可能性があることが観察されました (図3d）。 一方、キサントシンとキサンチンは酸化プリンの形を共有しており、C2 にカルボニルを特徴としており、これが阻害活性の原因となっている可能性があります。 これらの観察には相関関係があり、因果関係を確立するにはさらなる構造活性研究が必要です。

発芽受容体は多くの場合、L-アミノ酸発芽体の認識において立体特異的であり、一方の立体異性体が発芽を引き起こし、もう一方が発芽を阻害します。 Bacillus subtilis は典型的な例で、L-アラニン誘導発芽は D-アラニンによって阻害されます 31。 私たちは、L-システイン、L-アラニン、L-バリンによる発芽がそれらの立体異性体パートナーによって拮抗され、発芽シグナル伝達の階層に関する手がかりが得られるのではないかと考えました。

この疑問に答えるために、これら 3 つの因子に対する発芽反応を、D-システイン、D-アラニン、および D-バリンの存在下または非存在下で測定しました。 すべての発芽体はD-アラニンによって強く阻害され、これらの発芽体は物理化学的刺激ではなくシグナル伝達経路を通じて作用することが示されました（図4a、b）。 D-システインも阻害効果を示しましたが、発芽菌のサブセット（L-システインおよびL-バリン）に対してはそうではありませんでした。 D-アラニンの阻害効果は複雑な培地でも有効であり、マスター阻害スイッチとしての潜在的な役割を示しています。 (図4c)。 比較すると、D-システインは複雑な培地での発芽を可能にしました。 D-アラニンが他の細菌の胞子発芽を阻害する場合、D-アラニンは多くの場合、自己阻害と呼ばれる現象である早期発芽を最小限に抑える方法として、胞子ペプチドグリカンに存在するか、発芽中に放出されます。 LC-MS 分析により、これは C. novyi-NT の場合に当てはまり、D-アラニンは休眠胞子および発芽胞子のペプチドグリカンに存在し、栄養細菌と同様に、発芽中に培地に積極的に放出されなかったが、D-アラニンが存在することが示されました。 (図4d)。 LC-MS分析で使用された胞子の画像を補足図S3に示します。

候補D-アミノ酸阻害剤（91.5 mM）の存在下でのL-アミノ酸発芽体（91.5 mM）による発芽パーセント（補足表4に定義）の散布図プロット。 緑、赤、青の丸は、それぞれ L-システイン、L-アラニン、L-バリンを示します。 すべてのデータは平均±SD、n = 4の生物学的に独立したサンプルを示しています。 ****p ≤ 0.0001 での有意性 (対応のない t 検定)。 b (a) の結果の要約表。 c D-アラニン（93.5 mM）、D-システイン（93.5 mM）および水を含むRCM-FBSオキシラーゼ培地に一晩接種した胞子の位相コントラスト画像。 画像は 2 つの独立した実験を最もよく表したものです。 倍率 1600×、スケールバー 2 μm。 d L-アラニン、D-アラニンの標準物質、および休眠胞子、発芽胞子、栄養細菌、およびL-システイン中で発芽した胞子からの上清からのペプチドグリカン抽出物のサンプルの誘導体化アラニンイオン（351 m/z）のLC-MS EICスペクトル、L-アラニン、L-バリンまたはD-バリン。 点線は、それぞれ保持時間 13.4 分および 14.05 分の L-アラニンおよび D-アラニンの標準ピークを表します。 示されているデータは、2 つの独立した実験からの水ブランクを差し引いたスペクトルを最もよく表したものです。

最後の候補阻害剤である D-バリンは、発芽菌をまったく阻害しませんでしたが、それどころか、L-バリンによって誘導されるベースラインの発芽をさらに増加させるように見えました（図4a）。

D-バリンの結果に興味をそそられた私たちは、19 個の D-アミノ酸のパネルに対して単一因子発芽スクリーニングを実行しました。 驚いたことに、D-バリンは実際にC. novyi-NT胞子の発芽を引き起こすことができ、それが可能な唯一のD-アミノ酸でした（図5a）。 D-バリン発芽胞子は、位相差顕微鏡下では位相暗色に見えたため、この最初の結果が確認されました（図5b）。

a 19 個の D-アミノ酸の単一因子スクリーニング。各 D-アミノ酸が補足表 3 の濃度で発芽について個別にテストされました。破線は 10% の発芽閾値を表します。 D-アミノ酸は、発芽率の降順に左から右に並べられています。 D-スレオニンと比較した場合、****p ≤ 0.0001 (対応のない t 検定) で有意です。 b D-バリン (45.7 mM) で発芽した C. novyi-NT 胞子の倍率 1000 倍の位相コントラスト画像。 スケールバーは5μm。 c 最高濃度の D-バリンでの発芽に対して正規化された、さまざまな濃度の D-バリン (黒)、L-システイン (緑)、L-アラニン (赤)、および L-バリン (青) での発芽反応の用量反応曲線91.5mM。 円は個々の値を表します。 実線は最小二乗適合回帰曲線を示しています。 影付きの領域は、各 L アミノ酸の適合の 95% 信頼誤差バンドを示します。 EC50 値は凡例に示されており、D-バリンと比較した場合、***p ≤ 0.0001、***p ≤ 0.001、**p ≤ 0.01 (対応のない t 検定) で有意です。 d 他のD-およびL-アミノ酸（91.5 mM）の存在下でのD-バリン（91.5 mM）による発芽。 DIW 対照と比較した場合、****p ≤ 0.0001 (対応のない t 検定) で有意。 e LC-MS EIC スペクトル（L-バリン、D-バリン、および休眠胞子、発芽胞子、栄養細菌および L-システイン中で発芽した胞子からの上清のペプチドグリカン抽出物のサンプル）の標準物質に対する誘導体化バリン イオン（379 m/z）の EIC スペクトル、L-アラニン、L-バリンまたはD-バリン。 示されているデータは、2 つの独立した実験からの水ブランクを差し引いたスペクトルを最もよく表したものです。 点線は、それぞれ L-バリン (20.34 分) および D-バリン (20.73 分) の標準ピークを表します。 すべての発芽データは平均 ± SD、n = 4 の生物学的に独立したサンプルを示しています。 すべてのグラフの発芽率は補足表 4 で定義されています。

OD およびジピコリン酸 (DPA) 放出によって測定される D-バリン発芽の動態は、L-システインおよび L-アラニンと同様でした (補足図 S4)。 また、L-システインまたはL-アラニンと比較して、発芽を引き起こすために必要なD-バリンの濃度が大幅に低いことも判明し、D-バリンが発芽剤としてより強力であることを示しています（図5c）。 L-システインとL-バリンと同様に、D-バリンの発芽はD-システインとD-アラニンの両方によって阻害される可能性があり、D-バリンが真の発芽物質であるというさらなる証拠を提供します（図5d）。

D-バリンが独立して C. novyi-NT の発芽を誘発できるという観察は、L-アミノ酸が発芽を促進する一方、D-アミノ酸が発芽を阻害するという一般的な直観に反します。 特に D-バリンが細菌の胞子の発芽において積極的な役割を果たすことはこれまで示されていません。 D-バリンはシグナル伝達分子としての役割を果たす可能性がありますか?もしそうであれば、この D-バリンの供給源は何でしょうか? ほとんどの細菌は定常期に D-アミノ酸 (主に D-アラニン、D-グルタミン、場合によっては D-バリン) をペプチドグリカンに取り込むため 34、我々は D-バリンが胞子皮質ペプチドグリカン層の成分である可能性があるのではないかと考えました 34,35 、36、37。 この疑問に対処するために、休眠胞子、発芽胞子、および栄養細菌のペプチドグリカン層が抽出され、加水分解され、誘導体化LC-MSを使用して分析されました（図5eおよび補足図S3）。 この分析により、L-バリンが両方に存在するにもかかわらず、D-バリンが胞子または栄養型のペプチドグリカンに存在しないことが明らかになりました（図5e）。 さらに、L-システイン、L-アラニン、またはL-バリン発芽胞子サンプルの上清にはD-バリンが存在せず（図5eおよび補足図S3）、D-バリンが胞子ペプチドグリカンの構成成分ではなかったことを示しています。発芽時に放出されることもありません。 C. novyi-NT 胞子には L-バリンを生成する D-バリン特異的ラセマーゼが存在する可能性があると考えられます。 ただし、D-バリンで発芽した胞子ではL-バリンは検出されなかったため、これは考えられません（図5e）。

この胞子は D-バリンの供給源ではないことが示されており、C. novyi-NT が定着した哺乳類組織では D-バリンが不足していると推定されるため、D-バリンの類似体が実際に関連する発芽菌である可能性があるかどうかを尋ねました。 。 D-バリン類似体のコレクションをスクリーニングし（補足図S5）、発芽活性を示す5つの類似体を発見しました（図6a）。 興味深いことに、これらの類似体のうち 4 つは 2 対の立体異性体を含みました。 L-ノルバリンおよびD-ノルバリン、ならびにL-2-アミノ酪酸（L-AABA）およびD-2-アミノ酪酸（D-AABA）。 これら 2 つのペアはバリンに関する我々の観察を反映しており、L 鏡像体と D 鏡像体の両方が発芽活性を示しています。 D-アラニンとD-システインはL-バリンとD-バリンによって発芽を阻害することが以前に示されていたため、同じ実験を行ったところ、D-アラニンとD-システインもバリン類似体によって誘発される発芽を阻害できることが観察されました（図6b)。 これは、これらの類似体が L-バリンおよび D-バリンと同じシグナル伝達経路を通じて作用し、おそらく同じ発芽受容体を通じて作用することを示唆しています。 類似体の中で最も強い発芽物質である L-AABA と D-ノルバリンは、L-システインと同様の効力を持っています (図 6c)。

D-バリンの立体異性構造類似体の単一因子スクリーニング。 すべての類似体は 91.5 mM の濃度でした。 D-バリンおよびL-バリンを参照陽性対照として使用しました（灰色）。 発芽率が 10% を超えるすべてのバリン類似体 (緑色) が発芽体として識別されました。 4-アミノ酪酸と比較した場合、***p ≤ 0.0001、***p ≤ 0.001、**p ≤ 0.01、*p ≤ 0.05、ns p > 0.05 (対応のない t 検定) で有意。 b バリン類似体 (91.5 mM) L-2-アミノ酪酸 (オレンジ色の丸)、D-2-アミノ酪酸 (ピンク色の丸)、L-ノルバリン (濃い緑色の丸)、D-ノルバリン (紫色の丸)、S の発芽応答阻害剤 D-システインおよび D-アラニン (濃度 91.5 mM) の存在下での -(3)-アミノ酪酸 (灰色の丸)。 対応する水対照と比較した場合、***p ≤ 0.0001、***p ≤ 0.001、**p ≤ 0.01、*p ≤ 0.05、ns p > 0.05 (対応のない t 検定) で有意。 c さまざまな濃度のL-2-アミノ酪酸（オレンジ）、D-ノルバリン（紫）およびL-システイン（緑色）での発芽反応の用量反応曲線（最高濃度91.5 mMのD-バリンでの発芽に対して正規化）は、次のとおりです。 L-システインと同様のバリン類似体の効力。 円は個々の値を表します。 実線は最小二乗適合回帰曲線を示しています。 影付きの領域は、各アミノ酸の適合に対する 95% 信頼誤差バンドを示します。 EC50 値は凡例に示されています。 d C. novyi-NT発芽のための提案された2成分シグナル伝達フレームワーク。 すべての発芽データは平均 ± SD、n = 4 の生物学的に独立したサンプルを示しています。 すべてのグラフの発芽率は補足表 4 で定義されています。

私たちは、おそらくバリン、AABA、ノルバリンが栄養型 C. novyi-NT の代謝産物ではないかと考えました。 発芽した桿体からの代謝産物は、理論的には胞子の発芽をさらに促進する発芽剤として機能する可能性があります。 バリンとノルバリンのLC-MS分析は、液体培地で生育したロッドで実行され、ペレット化した栄養C. novyi-NTおよびその生育によって調整された培地には両方とも存在しないことが示されました（補足図S6a）。 技術的な理由から、AABA の同じ LC-MS 分析を寒天培地上で増殖させたコロニーに対して実行しました。 ここで、C. novyi-NTロッドにはL-AABAが存在していましたが、D-AABAは存在しなかったことが観察されました（補足図S6b）。 L-AABA は、C. novyi-NT の推定代謝物であることに加えて、敗血症の非特異的マーカーでもあり 38、ボツリヌス菌やソルデリ菌などの他の同様の壊死性クロストリジウム菌によって生成される代謝物でもあります 39,40。環境がL-AABAの潜在的な供給源であることが示唆されています。 これらの発見は、D-アミノ酸とその類似体が細菌の胞子の発芽においてまだ発見されていない役割を果たしている可能性があることを示唆しています。

DOE はこの研究において重要な役割を果たしました。 単一因子スクリーニングでは、L-システインと L-アラニンのみが発芽体として同定されるでしょう。 DOE と単一因子スクリーニングを組み合わせることで、組み合わせでのみ作用する発芽促進剤と阻害剤のさらなる発見につながり、D-バリンとその類似体を真の発芽促進剤として同定する一連の研究を推進しました。 独立して作用する単一の因子の効果は、組み合わせた因子の効果から逸脱する可能性があるため、このツールが細菌の胞子発芽研究でより一般的に使用されることを期待しています。 特に、このような因子間の相互作用は、胞子が生息する現実世界に存在する可能性があり、DOE は、組み合わせ空間をより効率的に調べて理解するための効率的な方法となります。

細菌胞子発芽体のスクリーニングにおける DOE のこの最初の使用において、我々は C. novyi-NT に対する主な発芽効果を特定しました。 完全な経路をまだ完全に説明することはできませんが、発芽シグナル伝達イベントのシーケンスの基本的な枠組みを推測するのに十分な情報があります（図6d）。 この純粋に仮説的な枠組みは、図 6d の要因の要約表に基づいており、より多くの実験データが利用可能になるにつれて修正する必要があります。 このフレームワークには、発芽物質と阻害物質からのシグナルを集約する 2 つのプレースホルダー要素 A と B があります。 ここで、B は A の下流にあり、発芽は B の下流にあります。D-アラニンはすべての発芽を阻害するため、最下流の要素である B に作用する可能性が高くなります。 対照的に、D-システインの阻害は絶対的なものではないため、要素 A の上流で作用する可能性があると考えられます。同様の推論を使用して、発芽株は D-システイン (L-システイン、L/D-バリンおよびその類似体) によって阻害されます。最後に、L-アラニンは D-システインの阻害を回避しますが、D-アラニンは回避しないため、下流の要素 B に作用する可能性があります。

A と B は、まだ特定されていない発芽シグナル伝達の参加者のプレースホルダーです。 どちらも単一または複数のシグナル伝達参加者を表す可能性があり、これらの参加者は C. novyi-NT ゲノム内の 2 セットの発芽オペロン (NT01CX_0189-0191 および NT01CX_0562-564) に由来する可能性があります 41。 特に、NT01CX_0191、NT01CX_0562、およびNT01CX_0564は、セレウス菌およびボツリヌス菌の発芽受容体ファミリー遺伝子と高い配列類似性を示し(補足表6)、したがって、将来の研究の興味深い候補である。

すべての発芽クラスの中で、L-アミノ酸だけがすべての既知の細菌胞子において発芽促進因子として普遍的に特徴付けられています。 アミノ酸発芽体の認識は、ほぼすべての胞子形成クロストリジウム属およびバチルス属に存在する Ger 型受容体によって促進されます 42。 この規則のまれな例外の 1 つは C. ディフィシルで、これは Csp 型受容体 (CspA) を使用します 43,44。 当然のことながら、クロストリジウム属を含むすべての発芽研究では、少なくとも 1 つのアミノ酸が前発芽物質 (つまり、発芽物質または共発芽物質) として同定されています 45。 C. novyi-NT のアミノ酸発芽促進因子は他のクロストリジウム菌とどのように比較されますか? 14 のクロストリジウム菌 (この研究の C. novyi-NT を含む) の調査では、L-アラニン (10/14) が最も一般的な発芽促進剤で、次いで L-システイン (7/14) でした (補足表 7)。 C. novyi-NT は、これら 2 つの L-アミノ酸を発芽促進剤として使用することで、この一般的な傾向に倣っています。 これら 2 つの L-アミノ酸に加えて、クロストリジウム菌は、より低い頻度で発芽促進因子として他の L-アミノ酸も特徴とします。 C. novyi-NT も例外ではなく、L-バリンに対して発芽反応を示します。 C. novyi-NT は、L-ノルバリンや L-2-アミノ酪酸などの古典的な L-アミノ酸ではない非標準発芽菌にも反応して発芽します。 この意味で、それらは、L-ノルバリンに応答する C. frigidicarnis 46、および L-ノルバリンと L-2-アミノ酪酸の両方に応答する C. difficile に似ています 47。 L-2-アミノ酪酸は、栄養発芽体として代謝的に重要である可能性があります。なぜなら、L-2-アミノ酪酸は、栄養型C. novyi-NTにおいて細胞内代謝産物として産生されるからです。 1 つの可能性は、L-2-アミノ酪酸の発芽が、初期の発芽胞子からの正のフィードバックとして作用し、さらなる発芽を促進することです。 さらに、L-2-アミノ酪酸のL-ノルバリンおよびL-バリンとの構造的類似性は、3つすべてが同じ発芽受容体に結合する可能性があることを意味します（補足図S5）。 これらの仮説を明らかにするには、さらなる研究が必要です。

現在までに、クロストリジウム菌に関して報告されている実質的にすべてのアミノ酸発芽促進物質は L-アミノ酸です。 この傾向から逸脱する唯一のクロストリジウム菌は、C. ビフェルメンタンス (D-アラニン、D-アルギニン、D-セリンを共発芽剤として使用する) 48,49、C. ディフィシル (D-アラニンまたは D-セリンを共発芽剤として使用する) です。共発芽体）50、およびこの研究では、C. novyi-NT（D-バリンおよびその類似体に応答して発芽する）。 C. ビフェルメンタンス、C. ディフィシル、および C. novyi-NT は、D-アミノ酸パネルが発芽促進活性についてスクリーニングされている、我々の知る限り唯一のクロストリジウム菌であるため、クロストリジウム菌における D-アミノ酸発芽菌の真の発生率は、過小評価される可能性が非常に高いです。

個々の L-アミノ酸発芽体は通常、D-アミノ酸の鏡像によって拮抗されるため、D-アミノ酸が発芽阻害剤として作用することはよくあることです。 したがって、我々は、D-バリンがL-バリンの発芽に拮抗できないだけでなく、D-バリンがL-バリンよりもさらに強力な発芽剤であることが判明したことに驚いた。 もう一つの予想外の観察は、D-アラニンが、複雑で豊富な培地である強化クロストリジウム培地中での胞子の発芽を妨げることでした。 経験的には、D-アミノ酸は、対応する L-アミノ酸よりも広範囲の発芽菌を阻害する可能性があります。 C. sporogenes を例にとると、D-セリンは L-セリン、さらに L-システイン、L-メチオニン、L-フェニルアラニンへの発芽を阻害することが示されています51。 D-アラニンも同様に、L-グルタミン、L-ノルバリン、L-セリン、L-メチオニン、L-スレオニンに対してBacillus thiaminolyticusの発芽を阻害することが示されており、同様です52。 これらの例にもかかわらず、この研究で D-アラニンで観察されたような一見絶対的な発芽阻害を示した過去の研究はありません。 可能性の 1 つは、豊富な複合培地での D-アラニン阻害をテストする研究が不足していることです。 別の説明は、C. novyi-NTの発芽シグナル伝達は単一のゲートキーパーに収束する可能性があるのに対し、他のクロストリジウム菌では発芽シグナル伝達の性質がより並列的であり、発芽を引き起こすまでの複数の冗長な経路がある可能性があるというものです。

C. novyi-NT 発芽の詳細はまだ具体化されていないが、この研究では 2 つの大きなテーマが強調されている。 まず、発芽因子は高度に独立して作用することも（L-システインやD-アラニンのように）、相互依存的に作用することもあります（L-アラニンやL-スレオニンなど）。 私たちは胞子発芽体を単独のアクターとして考えることに慣れてきましたが、私たちのデータは、特定のアミノ酸の発芽特性が他のアミノ酸の存在に応じて現れたり消えたりする可能性があることを示しています。 私たちの研究における PB スクリーンは相互作用の存在を示すことができますが、これらの相互作用を詳細に調査するように設計されていません。 したがって、これらの相互作用の性質を解明するには、さらなる研究が必要です。

2つ目のテーマは立体柔軟性です。 自然はキラリティーにうるさいため、胞子発芽受容体は通常、特定の L アミノ酸を同族発芽体として認識します。 一方、これらの発芽株に対する D-アミノ酸鏡像異性体はこれらの相互作用を妨害し、発芽を阻害する可能性があります 51。 このシンプルでエレガントなホモキラル モデルは、D-セリンと D-アラニンが C. ディフィシルの共発芽剤として機能する可能性があることを示す新しい研究を考慮して再考する必要があるかもしれません 50,53。 その研究では、アラニンラセマーゼであるalr2の遺伝的不活化により、これらのD-アミノ酸の共発芽活性が無効になり、発芽活性にはL型への変換が不可欠であることが示されました。 D-バリンからL-バリンへの変換に関与するラセマーゼ活性はC. novyi-NTの立体柔軟性を理論的に説明できるが、この研究ではそのようなラセマーゼ活性は検出されなかった。 あるいは、立体柔軟な方法でアミノ酸に結合する発芽受容体が C. novyi-NT に存在する可能性もあります。 これらの考えられる説明の間のあいまいさをなくすために、さらなる調査が必要であることは確かです。 C. difficile とは異なり、C. novyi-NT では D-バリンとその類似体は共発芽剤としてではなく一次発芽剤として作用し、主要な L-アミノ酸発芽剤である L-システインに匹敵する発芽効果を示します。 このデータは、ホモキラル モデルが不完全であるというさらに強力な証拠を提示します。

第一原理から推論すると、芽胞形成細菌の発芽語彙によって、それが生息するニッチが決まります。 したがって、発芽物質のセンシングは、いくつかの重要な栄養素に基づいているのではなく、環境の多重センシングに基づいていると期待するのは合理的です。 複雑な相互作用と立体柔軟なセンシングは、細菌胞子の真の発芽語彙への扉を開く鍵となる可能性があります。 これらはまた、C. novyi-NT の腫瘍定着能力を理解および改善するための初期の基礎を築く可能性があります。

固形腫瘍は血管新生が不十分で、低酸素と壊死の領域を含んでいます54。 この特性は、放射線療法や化学療法の転帰の不良と相関していますが、厳密に嫌気性のクロストリジウム菌の胞子が癌細胞に定着して死滅させる治療の機会も提供します55。 ただし、すべてのクロストリジウム菌がこの目的のために同じように作られているわけではありません。 すべてが偏性嫌気性菌ですが、ある研究では、試験した 8 株のうち 2 株 (C. novyi-NT および C. sordelli) のみが、実験用腫瘍の低酸素領域に効果的に定着することが判明しました4。

コロニー形成効率に影響を与える可能性のある要因の 1 つは、重要な発芽菌が腫瘍微小環境にどの程度存在するかです。 この点において、C. novyi-NT のいくつかの発芽促進因子は固形腫瘍に豊富に含まれています。 例えば、腫瘍内 L-システインは、特定の腫瘍で最大 1.40 mM に達することが示されており 56、血漿中の平均ベースライン約 0.2 mM を超えています 57。 腫瘍内システインレベルの上昇は、がん細胞を放射線療法 58 や化学療法 59 の影響から守ると考えられていますが、これらの治療耐性ニッチ内での C. novyi-NT の発芽も潜在的に促進する可能性があります。 実際、C. novyi-NTは、弱い発芽を達成するために、共発芽剤（ヒポキサンチンまたはイノシン）のいずれかと組み合わせて、わずか1 mMのL-システインを必要とします（補足図S2d）。

L-システインに加えて、共発芽物質であるヒポキサンチンとイノシンも同様に腫瘍に豊富に含まれています60,61。 どちらも癌細胞の増殖を促進するプリン代謝経路の基質であり、壊死組織や腐敗組織の死にかけている細胞から放出されます。 ヒポキサンチンが細菌胞子の発芽を促進することはこれまで知られていません。 一方、イノシンは、他の組織定着細菌と発芽菌 (セレウス菌 29、炭疽菌 62) または共発芽菌 (ボツリヌス菌 E63 型) として関与しています。 総合すると、L-システイン、ヒポキサンチン、およびイノシンの腫瘍濃度は定着に重要な影響を与える可能性があり、C. novyi-NT 胞子で治療された異なるがん患者間で観察される発芽の変動に寄与する可能性があります 64。

C. novyi-NT 胞子がどのように発芽するのかについてより完全な画像が得られたので、以前は反応しなかった腫瘍でも胞子の発芽を誘導できる可能性があり、その結果、さまざまな固形腫瘍にわたってより一貫した結果を達成できるようになります。 また、1 つ以上の発芽菌に対してより応答性の高い C. novyi-NT 株を操作することにより、この有望な癌治療薬の治療効果がさらに高まる可能性があります。

すべてのL-アミノ酸、D-アミノ酸（D-ヒスチジンを除く）、プリン、バリン類似体、塩化テルビウム（212903）、マルトース（M5895）、二塩基性リン酸ナトリウム（S7907）、o-フタルジアルデヒド（P0657）、N-アセチルシステイン (A7250)、四ホウ酸ナトリウム十水和物 (B3545)、HPLC グレードのメタノール (34860)、1-プロパノール (34871)、トリフルオロ酢酸 (302031) およびムタノリシン酵素 (M9901) は Sigma から購入しました。 2-プロパノール (29113-95) はナカライテスクから入手しました。 D-ヒスチジン (sc-255057) は SantaCruz Biotechnology から購入しました。 アセトニトリル (1.00317) および HCl (1.00029) は Merck から購入しました。 Percoll (17089109) は GE Healthcare から購入しました。 ブロス用のオキシラーゼは、Oxyrase Inc および Sigma から購入しました (SAE0013)。 BBL ポリペプトン ペプトン (211910)、乾燥調理肉培地 (226730)、ブレイン ハート インフュージョン ブロス (BHI、237500)、および強化クロストリジウム培地 (RCM、218081) は BD から購入しました。 ウシ胎児血清 (S1810) は iDNA Biotechnology から入手しました。

C. novyi-NT は、米国ジョン ホプキンス大学の Kinzler-Vogelstein 研究室から寄贈されました。

Clostridium novyi-NT 胞子は、Cheong et al.5 のプロトコールを使用して調製されました。 簡単に説明すると、5 × 109 CFU/ml の C. novyi-NT 胞子 200 μl を、1 l のポリペプトンおよび調理した肉に富んだ胞子形成培地 (L-システイン 0.5 g/l、二塩基性リン酸ナトリウムまたは Na2HPO4 5 g/l、 BBL ポリペプトンペプトン 30 g/l、脱水調理肉培地 50 g/l、マルトース 10 g/l および FBS 10% v/v) を使用し、培養物を密閉した BD GasPakTM 嫌気性ジャー内で胞子形成させ、37 °C で 3 分間インキュベートしました。数週間。 ペレットを1X PBSに再懸濁し、Beckman Avanti J-20 XP高性能遠心分離機で90% Percoll溶液を15000 rcfで30分間使用して栄養細胞から胞子を分離することによって、胞子を回収した。 胞子の品質は位相差顕微鏡法によってチェックされ、>99% の位相輝胞子が含まれていることが判明しました。 OD600 吸光度を細胞数に相関させる標準曲線を使用して、1 × PBS で適切に希釈することにより、胞子濃度を 5 × 109 CFU/ml に調整しました。

すべての胞子発芽実験は、Greiner Bio-One 384 透明マイクロウェル プレート (#781186) でブロス酵素のオキシラーゼを使用して嫌気的に実施されました。 嫌気性条件自体は発芽を引き起こしませんでした。 オキシラーゼ (1:50 v/v) と下記のさまざまな組み合わせで発芽体を含む発芽体溶液 50 μl に、1× PBS 中の 5 × 109 CFU/ml C. novyi-NT 胞子 3.5 μl を添加しました。 プレートをSealplateシーリングフィルムで気密にし、37℃で一晩インキュベートしました。 OD600 の読み取り値は、Tecan Spark® マルチモード マイクロプレート リーダーを使用し、Spark Control Dashboard V2.2 ソフトウェアを通じて 10 分ごとに測定しました。

すべてのエンドポイント発芽応答は、およそ時間 t = 7.3 時間で計算されました。 すべての DOE スクリーニング計画分析は、Minitab 20 を使用して実行されました。すべての DOE 実験のモデル適合パラメーターを補足表 8 に示します。すべての DOE 実験および単一因子ベースの発芽実験の発芽応答は、補足表に指定されているように計算されました。 4.

Plackett-Burman 計画は、N の組み合わせ (N は 4 の倍数) を使用して N-1 個の変数を研究するために高レベルと低レベルの濃度を使用する 2 レベルのフラクショナル要因スクリーニング デザインです。20 個の L-アミノ酸の場合、24 個の組み合わせが必要です。 Minitab19を使用したPlackett-Burman設計は、補足表1に示すように生成され、自動ワークステーションBiomek i5を使用して384ウェルマイクロタイタープレートにセットアップされました。各ウェルは、から調製された20種類のL-アミノ酸すべての特定の組み合わせで構成されていました。補足表 1 の各行に従ったマスターミックス。 20 種類の L-アミノ酸はすべて高ストック濃度で調製され、20 倍に希釈して胞子と混合すると、補足表 3 に示す最終濃度 (高レベル) が得られます。低レベル濃度はゼロに設定されました。

L-アミノ酸単一因子スクリーニングの場合、各ウェルにはアミノ酸が 1 つだけ含まれており、最終濃度は PB アッセイの 2 倍でした (補足表 3)。 D-アミノ酸単一因子スクリーニングも同様に実施しましたが、補足表 3 に示す胞子と混合したときの最終濃度を使用しました。 D-バリン類似体の場合、胞子と混合したときの最終濃度は 91.5 mM でした。 共発芽単一因子スクリーニングにおいて胞子と混合した場合のプリンの最終濃度は0.1 mMであり、一方、胞子と混合した場合に各ウェルに添加された最終L-システインレベルは10 mMであった。 生理学的レベルの発芽実験では、プリンと L-システインをそれぞれ最終濃度 0.1 および 1 mM で使用しました。

補足表 2 に示す完全な要因計画は、プリンによる発芽応答の研究および L-アミノ酸相互作用の研究に使用されました。 プリンを用いたコンビナトリアル発芽スクリーニングおよびコンビナトリアル共発芽スクリーニングのために、0.005 N NaOH中の各プリンの0.6 mMストック溶液を調製し、L-システインの非存在下および存在下（最終濃度10 mM）で希釈しました（最終濃度0.1 mM）。各ウェルは要因計画の 1 つの組み合わせを表します。 L-アミノ酸相互作用の研究では、L-システイン、PBおよび単一因子スクリーニングからのポジティブヒット、およびPBスクリーニングからのネガティブヒットをそれぞれ使用しました。 使用した濃度は補足表 3 と同じでした。すべてのアッセイは、Biomek i5 自動ワークステーションを使用して 384 ウェル マイクロタイター プレート上でセットアップされました。

発芽阻害の研究では、胞子と混合したときの両方の最終濃度がそれぞれ 91.5 mM になるように、等量の発芽体と鏡像異性阻害剤を加えました。 用量反応実験では、100 mM の発芽菌のストック溶液を脱イオン水で 90 μM の濃度まで 2 倍に連続希釈しました。 胞子と混合した場合の最終濃度は 91.5 mM ～ 89 μM の範囲でした。

ジピコリン酸放出アッセイでは、すべての発芽体を 200 mM の濃度で調製し、0.1 mM 塩化テルビウムとオキシラーゼ (1:50 v/v) を含む混合物で最終濃度 100 mM に希釈しました。 この溶液 50 μl に、C. novyi-NT 胞子 3.5 μl を Greiner Bio-One 384 UV スター マイクロタイター プレートに加えました。 胞子添加後の最終濃度は、発芽体については93.5 mM、テルビウムについては0.09 mMであった。 OD600 の読み取り値と 545 nm での蛍光 (遅延時間 20 μs) は、Tecan Spark® マルチモード マイクロプレート リーダーを使用し、Spark Control Dashboard V2.2 ソフトウェアを通じて 10 分ごとに測定しました。

オキシラーゼ(1:50 v/v)を含むRCM-FBS培地に、対応するD-アミノ酸または水を加え、続いて1.5mlエッペンドルフチューブ中のC. novyi-NT胞子を加えた。 成分の最終濃度は、93.5 mM D-アミノ酸、0.35× RCM、9.3% FBSでした。 次に、培養チューブを 37 °C で一晩インキュベートし、一晩培養したもののアリコートを画像化しました。

一晩の発芽/増殖実験のアリコート (10 μl) を Superfrost plus 顕微鏡スライドに加え、#1.5 顕微鏡カバースリップで覆い、マニキュアで密封しました。 次に、指定された倍率 1x または 1.6x の Optovar 設定に設定された 100x/1.4 Ph3 Plan APOCHROMAT 対物レンズを使用して、Zeiss 倒立 Axio Observer 7 顕微鏡でスライドを画像化しました。 画像は、Hamamatsu CMOS カメラと Metamorph ソフトウェア (Molecular devices、7.10.3) を使用し、位相コントラスト モードで 100 ms の露光時間でキャプチャされました。 画像は ImageJ バージョン 1.53n を使用してトリミングされました。

ペプチドグリカン抽出のプロトコルは、Atrih et al. から採用されました。 （1996、1998）および Popham et al。 (1996) 胞子については、Atrih et al。 (1999) 栄養細菌について。

簡単に説明すると、C. novyi-NT 胞子 (5 × 109 CFU/ml) 3 ml を、L-システイン (100 mM)、ヒポキサンチン (0.1 mM) およびオキシラーゼ (1 :50 v/v)、これを胞子で希釈すると、L-システイン (82 mM) およびヒポキサンチン (0.08 mM) の最終濃度が得られました。 等量の1X PBS中の休眠胞子と脱イオン水中の発芽胞子をそれぞれ1 mlのプロパン-2-オールおよびプロパン-1-オールに再懸濁し、85℃で15分間熱処理しました。 続いて、Beckman Coulter Microfuge 22R 遠心分離機を使用して 14000 × g で 8 分間遠心分離しました。 ペレットを、休眠胞子サンプルと発芽胞子サンプルの場合、それぞれ 13 ml と 1 ml の 50 mM Tris pH 7.4 – 4% SDS – 30 mM DTT-2mM EDTA 緩衝液に再懸濁しました。 次にサンプルを 100 °C で 16 分間加熱し、次に 37 °C で 40 分間加熱しました。

栄養細菌抽出物の場合、C. novyi-NTの一晩培養チューブ3本(チューブあたり5ml)を合わせて、1mlの脱イオン水に再懸濁した。 次にサンプルを 85 °C で 15 分間加熱し、14,000 × g で 8 分間遠心分離しました。 ペレットを10mlの5% SDSに再懸濁し、100℃で25分間加熱した。 サンプルを 14,000 × g で 8 分間遠心分離し、1 ml の 5% SDS に再懸濁し、再度 100 °C で 15 分間加熱しました。

それぞれの熱処理の後、胞子および栄養細菌サンプルを 14000 × g で 8 分間遠心分離し、ペレットを 37 °C に予熱した脱イオン水で 5 回洗浄しました。 最後の遠心後の上清を廃棄し、ペレットを250μlのムタノリシン酵素(12.5mMリン酸ナトリウム緩衝液pH5.8中125U/ml)で37℃で16時間処理した。 次にサンプルを 14,000 × g で 8 分間遠心分離し、上清を一晩凍結乾燥しました。 次に、凍結乾燥ペレットを Thermofisher 真空加水分解チューブ (カタログ番号 29570) 内で 1:1 6N HCl: トリフルオロ酢酸 (v/v) 中で加水分解し、油浴中で 160 °C で 1 時間加熱しました。 エッペンドルフ濃縮器を使用して酸を一晩蒸発させ、ペレットを脱イオン水中の200μlに再懸濁し、さらなる分析に送った。

アミノ酪酸分析のために、C. novyi-NTをPlas labsの嫌気性チャンバー内で5 mlのBHI-10%FBS培地中で一晩増殖させた。 １００マイクロリットルの一晩培養物をＢＨＩ－ＦＢＳ寒天プレート上にプレーティングし、対照プレートにはＢＨＩ－１０％ＦＢＳ培地を画線した。 翌日、1×PBS(500μl)を使用してコロニーを回収した。 溶液を、Beckman Coulter Microfuge 22R 遠心分離機を使用して、5000 rcf、5 分間、4 °C で遠心分離しました。 ペレットを５０％アセトニトリルに再懸濁し、Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｍｉｎｉビーズビーター２４を使用して均質化した（３５００回転／分、１分、４回）。 次に、サンプルを 16,000 rcf、4 °C で 10 分間遠心分離しました。 上清を凍結乾燥し、10% アセトニトリルに再懸濁し、さらなる分析に送りました。

ノルバリンおよびバリン分析のために、C. novyi-NT を Plas labs の嫌気チャンバー内で 5 ml の BHI-10%FBS 培地中で一晩増殖させました。 Thermo Scientific Sorvall ST 40R 遠心分離機を使用して、培養物を 4700 rcf、5 分間、4 °C で遠心分離し、さらなる分析のために上清を収集しました。 ペレットを５０％アセトニトリルに再懸濁し、Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｍｉｎｉビーズビーター２４を使用して均質化した（３５００回転／分、１分、４回）。 次に、サンプルを 16,000 rcf、4 °C で 10 分間遠心分離しました。 上清、ペレットおよび培地のみの対照サンプルを凍結乾燥し、10% アセトニトリル (ペレット) または水 (上清および培地対照) に再懸濁し、さらなる分析に送りました。

C. novyi-NT 胞子を、オキシラーゼ酵素 (1:50 v/v) を含む 91.5 mM (胞子による最終濃度) の L-システイン、L-アラニン、L-バリン、D-バリンおよび水中で 30 分間発芽させました。 37℃。 30 分後、発芽した胞子を 3900 rcf、5 分間でペレット化し、各サンプルからの上清をさらなる分析に送りました。

すべてのペプチドグリカン抽出物、代謝産物抽出物、および上清サンプルは、アセトニトリルおよび 10 mM ギ酸アンモニウム / 0.1% ギ酸溶媒を使用し、Phenomenex、Synergi 4 µm Fusion-RP 80 A° カラム上の Agilent 6546 LC/Q-TOF 装置を使用して分析されました。位相勾配。 サンプルは、メタノール (10%) 四ホウ酸ナトリウム緩衝液中で o-フタルジアルデヒドと N-アセチル システインを使用して誘導体化されました。 LC-MS EIC スペクトルは、MassHunter ソフトウェア (Agilent、B.08.00) および Microsoft Excel を使用して分析しました。

DOE 実験は、2 つの埋め込まれた技術的複製を使用して 2 回繰り返されました。 単一因子胞子発芽アッセイは、図 1c を除き、4 つの生物学的複製で実行されました。図 1c では、L-アスパラギンの 1 つの生物学的複製は、明らかな外れ値であるため除外されました。 外れ値検出の基準は、カットオフ 2.5 で [xi − 中央値(xi)]/(中央値からのすべての絶対偏差の中央値) として事前に確立されました。 外れ値を含めても実験結果は変わりません。 各発芽実験には 3.2 × 108 CFU/ml を超える胞子が使用されましたが、LC-MS 実験には 109 CFU/ml 程度の胞子が使用されました。 これは、アンダーサンプリングによりエラーが発生する可能性のある量をはるかに超えています。 組み合わせ実験の統計分析（ANOVA）はMinitab 20ソフトウェアを使用して実行されましたが、単一因子実験（対応のないスチューデントのt検定）の統計分析はGraphPad Prism v8.4.3を使用して実行され、正確なp値は補足表5に示されています。標準偏差を含む平均も、GraphPad Prism v8.4.3 を使用して計算されました。 代表的な LC-MS スペクトルは、各条件の少なくとも 2 つの独立したサンプルに基づいて決定されました。 代表的な画像は、少なくとも 2 つの独立したサンプルに基づいて取得されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 (およびその補足情報ファイル) に含まれています。 図のソースデータは補足データにあります。

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LC-MS 分析については、シンガポール国立大学 CMMAC 研究室の Steven Yuan 博士に感謝いたします。 この研究は、Temasek Life Sciences Laboratory Core Funding (http://www.tll.org.sg) (IC 宛) によって支援されました。 資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、原稿の準備には何の役割もありませんでした。

Mai Le Ngoc、Marvell Ung Wew、Varsha Ramkumar などの著者も同様に貢献しました。

テマセク生命科学研究所、シンガポール、シンガポール

アジタ スンダレサン、プラフラッド ラニンガ、ロンジ サム、イアン チョン

シンガポール国立大学生物科学部、シンガポール、シンガポール

アジタ・スンダレサン、ロンジ・サム、イアン・チョン

NUS 数学科学高等学校、シンガポール、シンガポール

マイ・ル・ゴック、マーベル・ウン・ウェウ、ヴァルシャ・ラムクマール

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概念化 (AS および IC)。 データキュレーション (AS、LNM、MWU、VR、IC)。 正式な分析 (AS、LNM、MWU、VR、および IC)。 資金調達（IC）。 調査 (AS、LNM、MWU、VR、PR、RS)。 方法論 (AS および IC)。 プロジェクト管理 (AS)。 ソフトウェア（IC）。 監督（ASおよびIC）。 検証 (AS)。 視覚化 (AS および IC)。 執筆 – 原案 (AS および IC)。 執筆 - レビューと編集 (AS、LNM、MWU、VR、PR、RS、IC)。

イアン・チョンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Yuting Ma と Gene Chong。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Sundaresan、A.、Le Ngoc、M.、Wew、MU 他。 実験計画法スクリーニングにより、クロストリジウム ノヴィイ NT 胞子発芽センシングがバリンおよびその類似体に対して立体柔軟であることが明らかになりました。 Commun Biol 6、118 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04496-9

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受信日: 2022 年 6 月 7 日

受理日: 2023 年 1 月 17 日

公開日: 2023 年 1 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04496-9

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